Observation de l'activité traductionnelle d'un ribosome unique par microscopie de fluorescence couplée à un système microfluidique
Institution:
Paris 11Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
This thesis recounts the conception and the realisation of an experiment about the study at the single molecule level of the prokaryotic ribosome activity. To do that, we use ribosomes and amino acids labeled with two fluorescent probes which emit at two different wavelengths. Thus, we are able to co-localize the ribosomes and the incorporated amino acids by single molecule total internal reflexion fluorescence microscopy. In order to count the number of incorporated amine acids, we study, at the single molecule level, the photophysical properties of their probe: the organic fluorophore Bodipy PL. We used a buffer containing an oxygen scavenger and two chemical reagents, one oxydant and one reductant, to increase the life-time, by a factor of 25, and the fluorescence stability in reducing the blinking at law laser excitation intensity. For the single molecule ribosome study, we developped a versatile microfluidic cell. The surface chemistry was carefully elaborated to eliminate non specific interactions between the surface and the biological reagents, and to preserve the ribosome activity. We incorporated a specific tag in the ribosome to label it with a semiconductor nanocrystal (QD). The activity of the ribosome labeled with a QD was observed in bulk experiment, then at the single molecule level. The Bodipy PL labeled amine acid incorporation by single ribosomes was also observed. Finally, we present the first steps of the conception of an optical tweezer to determine messenger RNA cohesion forces.
Abstract FR:
Ce mémoire retrace la conception et la réalisation d'une expérience portant sur l'étude à l'échelle de la molécule unique de l'activité traductionnelle du ribosome procaryote. Pour ce faire, nous utilisons un ribosome et des acides aminés lysines marqués spécifiquement avec deux marqueurs fluorescents ayant des spectres d'émission différents. Ainsi, nous pouvons colocaliser les ribosomes et les acides aminés incorporés par microscopie de fluorescence en réflexion totale (TIRFM). Pour compter les acides aminés incorporés, nous avons étudié, à l'échelle de la molécule unique, les propriétés photophysiques de leur marqueur : le fluorophore organique Bodipy FL. Nous avons utilisé une solution tampon appauvrie en oxygène et contenant des agents oxydants et réducteurs spécifiques pour augmenter sa durée de vie et sa stabilité. Nous avons ainsi augmenté la durée de vie d'un facteur 25 environ et réduit le taux de clignotement pour de faibles intensités d'excitation. Pour mener à bien notre étude du ribosome, nous avons développé une cellule microfluidique versatile. La chimie de surface a été particulièrement soignée pour éliminer toute interaction non spécifique entre la surface et les réactifs et pour conserver l'activité des ribosomes. Nous avons élaboré un marquage spécifique original du ribosome à l'aide d'un nanocristal semi-conducteur (QD). L'activité du ribosome marqué QD a été vérifiée en mesure d'ensemble puis observée en molécule unique. L'incorporation d'acides aminés marqués Bodipy FL par des ribosomes uniques a aussi été observée. Enfin, nous présentons les premières étapes de conception d'une pince optique pour mesurer des forces de cohésions de l'ARN messager.