Microscopie supercritique plein champ pour l’observation des membranes cellulaires
Institution:
Paris 6Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Numerous cell mechanisms involve membrane processes. The understanding of such processes is thus of crucial importance in biomedical applications. It explains the spectacular development of specific fluorescence imaging techniques like TIRF. We have developed an alternative full field imaging technique based on Supercritical Angle Fluorescence (SAF). When fluorescent emitters are placed in the vicinity of the glass slide, their near-field components become propagative at supercritical angles. This supercritical emission sharply decays with the fluorophore/surface distance with a characteristic decay length of about 100 nm. Selecting the supercritical emission thus provides an efficient way to realize spatial filtering but unfortunately also lead to a significant loss of lateral resolution. To overcome this drawback, we propose to use the spatial coherence of each single fluorescent emitter to generate interferences in fluorescence using a subtraction between two images. We show that apply this method on SAF components allows us to obtain an axial confinement of 100 nm without any degradation of the lateral resolution in a full-field configuration. Moreover, this technique allows us to simultaneously follow dynamic events both at the surface and more in-depth. Finally, this method easily provides an additional surface imaging capability to any microscope without major modifications.
Abstract FR:
Les processus membranaires sont impliqués dans de nombreux mécanismes cellulaires. La compréhension de ces phénomènes est cruciale en biologie, entraînant le développement de techniques de fluorescence spécifiques à l’imagerie de surface comme le TIRF. Nous avons développé une technique alternative d’imagerie plein champ utilisant le principe de l’émission supercritique (SAF). Quand les émetteurs fluorescents sont très proches de l’interface de verre, leurs composantes de champ proche deviennent propagatives à des angles supercritiques. Cette émission supercritique, encore appelée lumière interdite, décroît très rapidement avec la distance fluorophore/surface avec une longueur caractéristique de décroissance de 100 nm. Ainsi sélectionner l’émission supercritique permet un filtrage axial efficace au-delà de la limite de diffraction mais conduit malheureusement à une dégradation de la résolution latérale. Pour s’affranchir de cette difficulté, nous proposons d’utiliser la cohérence spatiale de chaque fluorophore pour générer des interférences en fluorescence à l’aide d’une soustraction entre deux images. Nous montrons qu’appliquer ces auto- interférences sur les composantes SAF permet un confinement axial de 100 nm sans aucune dégradation de la résolution latérale dans une configuration plein champ. De plus, notre technique permet de suivre simultanément la membrane et les parties internes de la cellule. Enfin, sa facilité d’implémentation permet d’ajouter une nouvelle fonctionnalité d’imagerie de surface sur n’importe quel microscope sans modification de celui-ci.