Développement de nouveaux outils chimiques pour la conception d'un système de détection fluorogénique des réactions catalysées par les polymérases
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Abstract EN:
During the past decade, considerable research efforts have been devoted to the field of bioanalysis of nucleic acids, and significant achievements have been done, particularly through the development of new methods for high-throughput DNA sequencing (HTS). This was made possible thanks to advances in optical detection methods, in particular fluorescence techniques which have some advantages including high sensitivity and ease of implementation. It is in this context that this current project takes place, whose ultimate and ambitious goal is the development of a novel fluorogenic system for real-time monitoring of DNA replication process. The main objective of this Ph. D. Thesis is to obtain a first proof-of-concept through the synthesis of a novel class of thionucleotides that only differ from the natural nucleotides by the replacement of the bridging-oxygen between phosphorus atoms Pα and Pβ by a sulfur atom ("P-S-P" moiety), to increase the nucleophilic character of the anion, released upon action of DNA polymerase (thiopyrophosphate (ThioPPi) instead of pyrophosphate). Subsequent reaction of ThioPPi with thiol-reactive latent fluorophores will enable detection of this enzymatic event. The first part of this work was devoted to the rational design and structural optimization of this pro-fluorescent system. Novel water-soluble phenol-based fluorophores derived from 7- hydroxycoumarin scaffold have been synthesized and the evaluation of their photophysical properties has been done. Their subsequent conversion to thiol-sensitive fluorogenic probes (reactive toward both ThioPPi and its decomposition product thiophosphate anion) through the chemical modification of their hydroxyl group was achieved. This comprehensive study has enabled us to select some latent fluorophores exhibiting both biocompatibility and high reactivity toward thiols, suitable for targeted application. The second part was devoted to the synthesis of original thionucleotides by exploring unusual synthetic strategies leading to "P-S-P" moiety; some valuable/interesting results were obtained. The third part aimed at highlighting some of the synthesized molecules in bioanalytical experiments.
Abstract FR:
Au cours de la dernière décennie, la (bio)analyse des acides nucléiques est un domaine qui a fait l’objet de nombreux travaux et qui a connu des avancées majeures, notamment au travers de la mise au point de nouvelles approches de séquençage à haut-débit (HTS). Ceci a été possible, notamment grâce aux progrès réalisés en matière de détection optique ; la fluorescence étant souvent privilégiée en raison de sa grande sensibilité et de sa facilité de mise en oeuvre. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet qui a pour but ultime le développement d’un nouveau système de détection fluorogénique permettant de suivre en temps réel la réplication de l’ADN. L’objectif principal de ce travail était d’obtenir une première preuve de principe via la synthèse d’une nouvelle famille de thionucléotides qui diffèrent des nucléotides naturels par la substitution de l’atome d’oxygène pontant entre les phosphores Pα et Pβ par un atome de soufre (motif "P-S-P"), et ce afin d’augmenter la nucléophilie de l’anion libéré au cours du processus de réplication (thiopyrophosphate (ThioPPi) au lieu du pyrophosphate (PPi)). Cet anion pourra alors réagir sur un système pro-fluorescent et induire la libération d’un fluorophore. Ainsi, la première partie de cette thèse a été consacrée à la conception et l'optimisation de ce système. De nouveaux fluorophores à phénol hydrosolubles à coeur 7-hydroxycoumarine ont été développés et nous avons évalué leurs propriétés optiques. Leur conversion en pro-fluorophores réactifs vis-à-vis des thiols (ThioPPi et son produit de dégradation l'anion thiophosphate) a ensuite étaient entreprise à travers la modification chimique de leur groupement hydroxyle. Ces travaux nous ont permis de sélectionner des pro-fluorophores dont la biocompatibilité et la réactivité vis-à-vis des thiols sont optimales pour l'application ciblée. Dans une seconde partie, nous avons exploré la synthèse des thionucléotides en développant des stratégies de synthèse originales du motif "P-S-P" ; des résultats préliminaires intéressants ont été obtenus. Dans une troisième partie, quelques pro-fluorophores développés ont été valorisés dans des expériences bioanalytiques.