Synthèse de complexes de lanthanides pour le marquage fluorescent de protéines : détection de protéines étiquetées poly-histidine
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Abstract EN:
The aim of this work is to develop a new fluorescent tool in order to specifically detect in cellulo poly-histidine tagged proteins (the histidine tag is the main tag incorporated in recombinant proteins) and then to determine their distribution and their interactions with other proteins. We chose to take advantage both of the known binding hability of histidine tag on metallic cations and of the spectroscopic properties of lanthanides and thus decided to create new lanthanide chelates which could specifically complex this tag with a significative increase of fluorescence. The synthesis of a first library of terpyridine chelates enabled us to prove the complexation of the poly-histidine tag with Eu3+ cation together with a two times fluorescence intensity increase and enabled us also to develop an original linker for the fluorescent labelling of proteins and peptides. Then, in order to increase the absorption maximum wavelength and then to obtain a tool compatible with biological media, we designed new ligands in which one or two pyridine rings were replaced by one or two pyrazine rings or in which terpyridine was replaced by pyridylhydrazone.
Abstract FR:
L’objectif de ce travail est le développement d’un nouvel outil fluorescent permettant de détecter spécifiquement des protéines étiquetées poly-histidine (principal tag utilisé lors de la purification des protéines synthétisées par génie génétique) et de déterminer ainsi leur répartition in cellulo et leurs interactions avec d’autres protéines. Voulant tirer parti de la capacité de l’étiquette poly-histidine à complexer les cations métalliques et des propriétés des complexes de lanthanide, nous avons décidé de développer de nouveaux complexes de lanthanides capables de reconnaître spécifiquement ce motif, cette reconnaissance s’accompagnant d’une augmentation significative de la fluorescence. La synthèse d’une première famille de complexes à structure terpyridine nous a permis de mettre en évidence une complexation du motif poly-histidine avec le cation Eu3+ (accompagné d’un doublement de l’intensité de fluorescence) d’une part, mais aussi de développer un nouveau bras de couplage pour le marquage fluorescent de peptides et protéines. Dans un second temps, le domaine spectral d’excitation de ces complexes de lanthanides n’étant pas compatible avec les milieux biologiques, nous avons entrepris la conception de nouvelles structures complexantes fondées sur deux motifs principaux : la substitution d’un ou deux noyaux pyridine par un ou deux noyaux pyrazine et l’utilisation du motif pyridylhydrazone comme structure complexante.