L'alpha-glucosidase neutre : structure et fonction de la protéine
Institution:
Paris 11Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Neutral a-0-glucosidase which is purified after solubilization by Triton X-100 can easely be integrated in artificial vesicles. The fact that this enzyme bound to native and artificial membrane vesicles, exhibited the same antibodies-binding which is equivalent to that of the proteolytic form, demonstrated the free accessibility of the antigenic sites to specific antibody. Neutral a-0-glucosidase activity, associated with both membrane system, presented the same single activation energy and a Q10 as that observed for the proteolytic form of the enzyme, over the temperature range studied. This result which could be correlated with the external location of the bulk of the hydrophilic part of the enzyme was confirmed by proteolytic treatments using proteinases of various shapes. Findings allow us to conclude that the topology of the enzyme integrated in artificial membrane vesicles is the same as that of the native membrane bound enzyme. Horse kidney Neutral a-0-glucosidase integrated in native membranes or in proteoliposomes exhibited its hydrophilic part separated, out of the membrane surfaces, by a 2-5 nm junctional polypeptide segment.
Abstract FR:
L’ α-D-glucosidase neutre du rein de cheval (α -D-glucoside glucohydrolase EC 3. 2. 1. 20) a été purifiée sous une forme protéolytique par chromatographie d’ affinité. Les propriétés moléculaires, immunologiques et catalytiques de l'enzyme ont été déterminées. Un modèle minimum décrivant le fonctionnement du site actif a été proposé. L' enzyme a également été purifiée sous sa forme intégrale, sa nature amphipatique a été clairement établie. L’étude de la susceptibilité de la protéine vis-à-vis de différentes enzymes protéolytiques a permis de démontrer que l' α -D-glucosidase neutre possède un peptide intermédiaire de 2 à 5 nm. Une technique de préparation de protéoliposomes, constitués par des lécithines et des protéines intégrales de la membrane de bordure en brosse du rein de cheval, a été mise au point. Cette méthode permet d’obtenir des vésicules qui ont conservé les caractéristiques essentielles du transport du glucose et de la L-alanine, notamment la dépendance vis-à-vis des ions sodium. Cette méthode permet d'insérer l' α-D-glucosidase neutre sous sa forme intégrale, seule ou en association avec d'autres protéines. Une intégration asymétrique de la protéine, dans l'orientation qu'elle possède au sein de la membrane native ainsi qu' une topologie identique sont retrouvées dans les protéoliposomes formés. L'utilisation de ce modèle artificiel permet d'étudier le rôle de l'enzyme dans le transport du glucose. Les résultats obtenus avec du glucose libre ou du glucose produit par hydrolyse du maltose démontrent l'absence de toute participation de cette protéine dans le transfert transmembranaire de ce soluté.