Expression et caractérisation de la lipoxygénase recombinante d'olive : une enzyme présentant une double spécificité d'hydroperoxydation et exprimée dans les derniers stades de développement des fruits
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Abstract EN:
Plant lipoxygenases (LOXs, EC 1. 13. 11. 12) are a class of widespread dioxygenases catalyzing the hydroperoxidation of polyunsaturated fatty acids. Although multiple isoforms of LOX have been detected in a wide range of plants, their physiological roles remain to be clarified. With the aim to clarify the occurrence of LOXs in olives and their contribution to the elaboration of the olive oil aroma, we cloned and characterized the first cDNA of the LOX isoform which is expressed during olive development. The open reading frame encodes a polypeptide of 864 amino acids. This olive LOX is a type-1 LOX which shows a high degree of identity at the peptide level towards hazelnut (77. 3%) and tobacco (76. 3%). LOXs. The recombinant enzyme shows a dual positional specificity, as it releases both 9- and 13-hydroperoxide of linoleic acid in a 2:1 ratio. Although a LOX activity was detected throughout the olive development, the 9/13-LOX is mainly expressed at late developmental stages. Our data suggest that they are at least two Lox genes expressed in black olives, and that the 9/13-LOX is associated with the ripening and senescence processes. However, due to its dual positional specificity and its expression pattern, its contribution to the elaboration of the olive oil aroma might be considered. We modified substrate accessibility to olive LOX active site. Phe277 and Tyr280 were replaced by short chain residues (Ala and Ile) at the active site entrance. Those mutants (F277A, Y280I and F277A/Y280I) were expressed in E. Coli and partially purified. A 4-fold conversion rate of linoleic acid was observed with F277A and F277A/Y280I mutants in comparison to recombinant olive LOX. Kinetic parameters of F277A and F277A/Y280I mutants were similar to soybean LOX1.
Abstract FR:
Les lipoxygénases (LOXs, EC 1. 13. 11. 12) sont des dioxygénases qui catalysent l'hydroperoxidation des acides gras polyinsaturés. Bien que de nombreuse isoformes de LOXs aient été caractérisé chez de nombreux végétaux, leur rôle physiologique reste inconnu. Dans le but d'éclaircir le rôle des LOXs dans l'olive et leur contribution dans l'élaboration de l'arôme, nous avons cloné et caractérisé un ADNc codant pour une isoforme de LOX d'olive exprimé dans les derniers stades de maturation du fruit. Cet ADNc présente un cadre de lecture ouvert qui code pour une protéine de 864 acides aminés. Cette LOX d'olive fait partie des LOXs de type-1 et présente un fort pourcentage d'identité avec la LOX de noisette (77,3%) et la LOX de tabac (76,3%). L'enzyme recombinante présente une double spécificité, elle produit des 9- et des 13-hydroperoxydes dans un rapport 2:1. Bien que l'activité LOX soit détectée à tous les stades de développement des olives, la 9/13-LOX est uniquement exprimé dans les stades noirs. Nos résultats suggèrent qu'il existe au moins deux gènes lox exprimés dans les olives noires, et que la 9/13-LOX est associé aux phénomènes de maturation et de sénescence. Cependant, en considérant sa double spécificité de substrat et son profil d'expression, nous ne pouvons pas exclure que cette enzyme puisse jouer un rôle dans l'élaboration de l'arôme. Nous avons modifié l'accessibilité au site actif de la LOX d'olive en mutant les résidus Phe277 et Tyr280 situés à l'entrée du site actif par des résidus à chaîne latérale courte (Ala et Ile). Nous avons exprimé les mutants F277A, Y280I et F277A/Y280I chez E. Coli et nous les avons partiellement purifié. Les mutants F277A et F277A/Y280I présentent un taux de conversion de l'acide linoléique 4 fois supérieur à celui de la LOX d'olive non mutée et ont des paramètres cinétiques similaires à la LOX1 de soja.