L' immunisation génique : une stratégie originale pour produire des anticorps dirigés contre le récepteur NK1 de la substance P
Institution:
Paris 11Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Structural and functional analysis of membrane-bound receptors often requires to use antibodies directed against the native form of the protein. Such antibodies are difficult to obtain by classical immunization protocols and thus we used DNA immunization, mainly devoted until now to vaccination purpose, to produce antibodies recognizing a native form of the human NK1 receptor (hNK1R) for the neuropeptide substance P (SP). Immunization protocols of mice either by intramuscular injection or gene gun delivery with the eDNA of the hNKlR generated antibodies directed against the native form of the hNK1R expressed on CHO cells membranes as assessed by FACS and immunofluorescence analysis, sorne of them apparently binding the second extra cellular loop of the hNK1R. To optimize this immunization strategy by enhancing the efficiency of antigen processing, we developped a plasmid vector encoding a secreted recombinant protein corresponding to the extracellular parts of the hNK1R. (E-hNKlR). Using this vector as an immunogen, we obtained antibodies able to recognize E-hNKlR through immuno-analysis and westem-blotting in all sera of mice after intramuscular injection. Finally, to favour the production of anti-receptor antibodies specifically directed against the SP binding site on the hNK1R , we used an idiotypic DNA vaccine approach. Our preliminary results show that the use of a plasmid containing the cDNA of a ScFv derived from a monoclonal anti-SP antibody coupled to a sequence coding a tetanus toxin fragment, induce a strong antibody response against the mmunogen. The antibodies produced through this strategy could be helpful to better characterize the hNK1R. Moreover, the techniques developed here could be used to generate antibodies directed against others membrane proteins.
Abstract FR:
Les études structurales et fonctionnelles de récepteurs membranaires nécessitent souvent l'utilisation d'anticorps reconnaissant la protéine sous forme native. De tels anticorps étant difficiles à obtenir par les techniques classiques d'immunisation, nous avons utilisé l'immunisation génique, une méthode jusque-là employée essentiellement dans le but de vaccination, pour produire des anticorps contre le récepteur NK1 humain (RNK1h) du neuropeptide substance P (SP). Nos résultats indiquent que des souris, immunisées par voie intramusculaire ou intradermique (grâce à un pistolet à gène), avec l'ADNe du RNK1h, expriment des anticorps capables de reconnaître ce récepteur présent à la surface des cellules CHO dans sa conformation native, comme le montrent des expériences de cytométrie de flux et d'immunofluorescence ; Certains anticorps sont spécifiquement dirigés contre la seconde boucle extracellulaire de RNK1h. Afin d'optimiser la stratégie d'immunisation en augmentant l'efficacité de présentation de l'antigène au système immunitaire, nous avons construit un vecteur d 'expression permettant la sécrétion d'une protéine recombinante comportant l’ensemble des parties extracellulaires du récepteur (E-RNK1h). L'utilisation de cette construction, comme immunogène, nous a permis de détecter, par des techniques d'immuno-analyse et d'immuno-empreinte, la présence d'anticorps dirigés contre E-RNK1h dans la totalité des sérums de souris immunisées par voie intra-musculaite. Enfin, de façon à favoriser la production d'anticorps anti-récepteur spécifiquement dirigés contre le site de liaison de la SP, nous avons combiné l'immunisation génique et l'approche anti-idiotypique. Nos résultats préliminaires, montrent que l'utilisation d'un plasmide contenant l'ADNe du ScFv d'un anticorps monoclonal anti-SP couplé à une séquence codant un fragment de la toxine tétanique induit chez les animaux immunisés une forte production d'anticorps contre la protéine immunogène. Les anticorps produits au cours de ce travail devraient permettre de mieux caractériser le RNKlh de la SP. D'autre part, les techniques développées pourraient être appliquées à la production d'anticorps contre d'autres protéines membranaires peu immunogènes.