Régulation de l'isoforme d'AMPc-phosphodiestérase PDE4D3 par l'acide phosphatidique : localisation d'un site spécifique de liaison et conséquences pour la signalisation cellulaire dépendante de l' AMPc.
Institution:
Lyon, INSADisciplines:
Directors:
Abstract EN:
Hormones and growth factors induce in many cell types the production of phosphatidic acid (PA), which has been proposed to play a role as a second messenger. Moreover, in acellular system, PA selectively stimulates certain isoforms of cAMP-phosphodiesterases (PDE4) carring a specifie regulatory domain, such as the PDE4D3 isoform. We have studied the mechanism by which PA activates the PDE4D3 isoform, and addressed the physiological meaning of the P AIPDE4 interaction in intact cells. For this purpose, we used transiently transfected MA10 cells overexpressing the PDE4D3 isoform. We showed that the treatment of these cells with inhibitors of PA degradation, including proprano lol, induced an accumulation of endogenous PA accompanied by a stimulation of PDE activity, and a significant decrease in both cA1\1P levels and protein kinase A-activity. Similar observations were also made in FRTL5 cells which naturally express the PDE4D3 isoform. By a radioisotopic labeling of endogenous phospholipids in MAlO cells overexpressing PDE4D3, followed by an immunoprecipitation of the protein, we demonstrated that endogenous PA was specifically bound to PDE4D3. A PA binding site on PDE4D3 was characterized using directed mutagenesis strate gy. Deletion of aminoacids 31 to 59 in the N-terminal regulatory domain of the enzyme abolished both PA activating effect and PA binding, suggesting that this region contains a PA binding site. Our results suggest that endogenous PA can modulate cAMP levels and consequently cAMP-dependent signaling pathway in intact cells, through a direct interaction with phosphodiesterases.
Abstract FR:
L'acide phosphatidique (PA), synthétisé dans de nombreux types cellulaires en réponse aux hormones ou facteurs de croissance, est considéré comme un second messager potentiel. De plus, en système acellulaire, le PA stimule certaines AMPc-phospho-diestérases (PDE4) qui possèdent un domaine régulateur spécifique, dont l' isoforme PDE4D3. Nous avons étudié le mécanisme d'activation de l'isoforme PDE4D3 par le PA, et cherché à démontrer la pertinence physiologique de cette interaction PA / PDE4 dans les cellules intactes. Pour cela nous avons utilisé des cellules MA10 transfectées surexprimant l'isoforme PDE4D3. Nous avons montré que la traite mêne de ces cellules par des inhibiteurs de la dégradation du PA, dont le propranolol, provoque une accumulation de PA endogène qui s'accompagne d'une stimulation de l'activité PDE4 et d'une diminution des taux d'AMPc et de l'activité protéine kinase AMPc dépendante. Nous avons observé des effets comparables dans les cellules FRTL5 qui expriment naturellement PDE4D3. Par un marquage radio-isotopique des phospholipides endogènes de cellules surexprimant PDE4D3, suivi d'une immuno-précipitation de la protéine, nous avons montré que le PA endogène se fixe spécifiquement à PDE4D3. Nous avons enfin caractérisé un site spécifique de fixation du phospholipide, en montrant, à l'aide de techniques de mutagénèse dirigée, que la délétion des acides aminés 31 à 59 du domaine régulateur de PDE4D3 supprime l'effet activateur ainsi que la fixation du PA. Nos résultats suggèrent que le PA endogène peut moduler les taux d'AMPc et la signalisation AMPc-dépendante dans les cellules intactes, par une activation directe de PDE4D3.