Caractérisation biochimique et biophysique de protéines impliquées dans des pathologies humaines : activité enzymatique des domaines de liaison aux nucléotides de la protéine de résistances aux drogues MRP1 et informations structurales par RMN du solide sur la protéine du prion
Institution:
Paris 6Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
In the present work we dealt with two independent projects. The aim of the first part was to produce and functionally and/or structurally characterize the two nucleotide-binding domains (NBD1 and NBD2) of the human ABC transporter ABCC1/MRP1, which are needed to power the transport of substrates across the cell membrane, e. G. The export of chemotherapeutics from cancer cells. While a crystal structure together with functional reports are available for isolated NBD1, it has so far not been possible to produce large quantities of monomeric NBD2 to enable a more extensive structural/enzymatic characterization. Here, we tested a series of new approaches to increase the solubility of NBD2 expressed as a recombinant protein in E. Coli, including the use of different constructs, co-expression of chaperones, expression in inclusion bodies and refolding. Unfortunately this did not sufficiently improve the quality of NBD2 samples in terms of oligomeric state to envisage further investigation by NMR. In contrast, NBD1 could be produced and purified. The wildtype protein together with an a priori non ATP-binding mutant were tested for adenylate kinase activity, which had been reported for other ABC transporters, but which we showed not to be part of the activity spectrum of NBD1. In the second part we dealt with the H2H3 domain of the transmissible spongiform encephalopathy causing protein PrP in its amyloid conformation. The main objective was to improve sample quality for solid state NMR measurements by oligomerization pathway selection. Within the scope of this project we could show that the H2H3 domain is sufficient for structural information transference during fibrillation
Abstract FR:
Ce travail comporte deux projets indépendants. L'objet du premier était de produire et de caractériser les deux domaines de liaison aux nucléotides (NBD1 et NBD2) du transporteur ABC humain ABCC1/MRP1 d'un point de vue fonctionnel et/ou structural. Ceux-ci fournissent l'énergie nécessaire au transport de substrats à travers la membrane, en particulier pour l'export de molécules utilisées en chimiothérapie par des cellules cancéreuses. L'enjeu était de produire de grandes quantités du domaine NBD2 monomre pour des études structurales. Plusieurs approches ont été utilisées pour augmenter la solubilité de NBD2 sous forme de protéine recombinante dans E. Coli : différents construits, co-expression de chaperons et expression en corps d'inclusion suivie de renaturation. Mais la qualité des échantillons n'a jamais été suffisante pour envisager de poursuivre, par RMN en particulier. NBD1, dont la structure était déjà disponible, a été produit et purifié. La protéine sauvage ainsi qu'un mutant ne liant plus les nucléotides ont été testés pour une activité adénylate kinase, mise en évidence pour d'autres transporteurs ABC. Nous avons montré que dans le cas de MRP1 cette activité n'était pas liée à NBD1. Une deuxième partie a été consacrée à l'étude de la forme amyloïde du domaine H2H3 de la protèine du prion PrP, responsable d'encéphalopathies spongiformes transmissibles. L'objectif principal était l'amélioration de la qualité des échantillons pour des études par RMN du solide par sélection des voies d'oligomérisation. Au cours de ces études, nous avons pu montrer que le domaine H2H3 était suffisant pour transférer l'information structurale au cours du processus de fibrillisation