Abstract FR:

Compte tenu de son role primordial dans le processus de replication virale, la protease du virus vih-1 est une cible privilegiee pour lutter contre le syndrome de l'immunodeficience acquise (sida). Avec les inhibiteurs de la transcriptase inverse, les inhibiteurs de la protease du vih-1 sont les seules molecules actuellement utilisees en clinique humaine. Recemment, l'association de ces deux types d'inhibiteurs (tritherapie) a donne des resultats tres encourageants, conduisant dans certains cas a une diminution du taux de virus dans le sang en dessous du taux detectable par les techniques actuelles. Jusqu'a present, les inhibiteurs de la protease utilises en therapie sont des analogues de l'etat de transition. Cependant, l'apparition de resistances chez des malades traites a mis l'accent sur l'importance du developpement de molecules agissant selon des mecanismes differents. Le travail presente dans cette these s'inscrit dans ce cadre puisqu'il concerne l'etude enzymologique d'inhibiteurs de la protease du vih-1 nouvellement concus. Il s'agit notamment d'inhibiteurs agissant irreversiblement sur le site actif (substrats suicides) et d'inhibiteurs ayant un site d'interaction different (inhibiteurs de la dimerisation). Ces etudes ont ete conduites au sein d'un reseau francais et d'un reseau europeen associant plusieurs laboratoires. Les substrats suicides peptidiques dont l'etude a ete initiee presentent potentiellement une double fonctionnalite. L'hydrolyse catalytique de la liaison scissile doit liberer d'une part une entite alkylante pouvant inactiver l'enzyme par modification chimique d'un acide amine du site actif, d'autre part, un n-glyoxylyl peptide susceptible de realiser une inhibition reversible. L'etude sur des n-glyoxylyl peptides, molecules originales, synthetisees separement, a demontre pour la premiere fois les capacites inhibitrices de ces structures (k i de l'ordre du micromolaire) et la necessite de la fonction n-glyoxylyl pour que se manifeste l'inhibition. L'existence d'une coupure selective au niveau du site souhaite a ete demontree a l'aide d'une molecule depourvue de la fonction alkylante latente. Les 4 brins c- et n-terminaux de la protease organises en feuillet- antiparallele etant responsables de 50% de l'energie d'interaction entre les deux monomeres, cette region a ete choisie comme cible pour elaborer des inhibiteurs de la dimerisation. Un travail exploratoire a ete realise concernant les premieres molecules de deux series en cours de developpement : (1) molecules presentant deux brins peptidiques relies entre eux par differents espaceurs ce qui leur confere une forme de pince ; (2) peptides susceptibles de creer une liaison covalente avec le residu cysteine 95 de l'extremite c-terminale de la protease. Afin de caracteriser le mecanisme d'action de molecules susceptibles d'etre des inhibiteurs de la dimerisation, un test cinetique a ete introduit dans le laboratoire qui permet de distinguer un inhibiteur de la dimerisation d'un inhibiteur du site actif et qui permet egalement la determination de la constante de dissociation k d de la protease dimerique (forme active). Enfin, le pouvoir inhibiteur de diverses series de molecules visant le centre actif a egalement ete evalue. Il s'agit : d'inhibiteurs steriquement contraints preorganises pour optimiser les interactions avec le site actif ; d'inhibiteurs possedant un axe de symetrie c 2 coincidant avec celui de la protease ; d'inhibiteurs pseudopeptidiques ; de trifluoromethyl cetones peptidiques et d'un complexe metallique non peptidique chef de file d'une serie originale decouverte par criblage de banques de donnees. Ces composes se comportent comme des inhibiteurs competitifs avec des constantes d'inhibition (k i ou ic 5 0) generalement de l'ordre du micromolaire. L'etude des series d'inhibiteurs a necessite dans un premier temps la mise au point de deux tests spectrophotometriques miniaturises permettant de detecter dans des conditions de bonne reproductibilite l'activite de l'enzyme, ainsi que la mise en place de techniques pour produire et purifier la protease du vih-1 a partir de souches bacteriennes recombinantes