Purification de protéines recombinantes du virus de l'hépatite C. Application au diagnostic
Institution:
Aix-Marseille 3Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
The Hepatitis C virus (HCV), first isolated in 1988, is the causative agent of most parenterally transmitte non-A, non-B hepatitis. Chronic HCV infection affects 1-2 % of the French population, and is a major public healthcare problem. The mode of contamination of HCV is poorly defined, and no vaccine is currently available, making detection of the disease essential. Since no native antigen has been isolated, the development of a screening test for the detection of HCV-specific antibodies present in the sera of infected patients requires recombinant proteins of the virus to be obtained. The structural nucleocapside protein (Core), the E2 envelope protein and the non-structural protein C33 possess numerous antigenic regions. The purpose of this research was therefore to develop purification techniques for these proteins, which are overexpressed in the form of fusion proteins, to integrate these techniques in diagnostic applications (detection of anti-HCV antibodies and antigenemia) and to select the constructions most adapted to HCV diagnosis. Highly glycosylated, the E2 protein is produced in a heterologous eucaryote system (insect cells infected with a recombinant baculovirus), whereas the Core and C33 proteins are overexpressed in Escherichia coli. Different genetic constructions in fusion with a 6-His tag, and including the amino acids 1-48, 1-119, 1-120 and 1-191 of the Core protein (191 amino acids), were purified on chromatographic supports and using electrophoretic techniques. The nucleotide sequence of the C33 protein (272 or 93 amino acids) was expressed in fusion with the glutathione S-transferase or the 6-His tag, and the proteins were purified on affinity supports. A comparative study of proteins GST-C33 (272 aa) and C33-H showed that the histidine system results in both easier purification of the proteins and increased detection sensitivity of the antibodies when using these C33 constructions for diagnostic purposes. The detection senstivity of anti-Core immunoglobulins is optimized with a recombinant protein which uses only the first 119 amino acids of the Core protein.
Abstract FR:
Le virus de l'hépatite C (VHC), découvert en 1988, est responsable de la plupart des hépatites non-A non-B à transmission parentérale. Véritable problème de santé publique, l'infection chronique par le VHC touche 1 à 2 % de la population française. Son dépistage est donc de la plus grande importance du fait d'un mode de contamination mal défini et de l'absence de vaccin. En absence d'antigène natif, la mise au point d'un test de dépistage détectant les anticorps spécifiques du VHC présents dans les sérums des patients infectés nécessite l'obtention de protéines recombinantes du virus. La protéine structurale de nucléocapside (Core), la protéine d'enveloppe E2 et la protéine non structurale C33 possèdent de nombreuses régions antigéniques. L'objet de ce travail a donc été de développer des stratégiesde purification de ces protéines, surexprimées sous forme de protéines fusion, de les intégrer dans des applications diagnostiques (détection d'anticorps anti-VHC et antigénémie) et de sélectionner les constructions les plus adaptées au diagnostic du VHC. Fortement glycosylée, la protéine E2 est produite dans un système hétérologue eucaryote (cellules d'insectes infectées par un baculovirus recombinant) tandis que les protéines Core et C33 sont surexprimées chez Escherichia coli. Des constructions génétiques différentes en fusion avec un motif 6-His et incluant les acides aminés 1-48, 1-119, 1-120 et 1-191 de la protéine Core (191 acides aminés) ont été purifiées sur supports chromatographiques et par des méthodes électrophorétiques. La séquence nucléotidique de la protéine C 33 (272 ou 93 acides aminés) a été exprimée en fusion avec la glutathione S-transférase ou avec le motif 6-His et les protéines ont été purifiées sur des supports d'affinité. L'étude comparée des protéines GST-C33 (272 aa) et C33-H a montré que le système histidine aboutit d'une part à une purification plus aisée des protéines et d'autre part, à une augmentation de la sensibilité de détection des anticorps lors de l'utilisation de ces constructions C33 à des fins diagnostiques. La sensibilité de détection des immunoglobulines anti-Core est optimisée avec une protéine recombinante ne comprenant que les 119 premiers acides aminés de la protéine Core.