Nouvelles stratégies d'ancrage de protéïnes sur une surface de phosphonate de zirconium
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Abstract EN:
Miniaturization, automation and high troughput of analysis belong to the current challenges of the genomics and more recently of the proteomics. Progress of nanotechnologies in these fields, in particular with the advent of the biological chips, aim to solve this problem. In this context, we developped two strategies for dense and orientated protein immobilization onto a zirconium phosphonate coated glasss slide:the first one involve synthesis of two bifunctional adaptors. One or two NTA units were conjugated to a multivalent phosphonic acid dipode which interacts strongly with the zirconated monolayer. Zirconated surface fonctionnalized with these linkers have been demonstrated to provide a new selectivity for histagged protein anchoring. The second one involve engineering of a multiphosphorylable tag by Casein Kinase II (CKII) consisting in a nanocluster of four serines. Merged to the C terminal end of an affitin, this tag was demonstrated to be totally and specifically phosphorylated in vitro by CKII. This original phosphate nanocluster based strategy was demonstrated to be effective for selective protein immobilization onto the zirconated support. These both strategies provided uniform orientation of proteins on the chip surface and a higher density of coupling compared to commercial supports. This new technology provides a very high selectivity of anchoring and exhibits high signal to noise ratio compared to other functionalized supports.
Abstract FR:
Miniaturisation, automatisation et rapidité d'analyse font partie des challenges actuels de la génomique et plus récemment de la protéomique. Le développement des nanotechnologies dans ces domaines, notamment avec l'avènement des puces biologiques, tente de répondre à cette problématique. Dans ce contexte, nous avons développé deux stratégies pour permettre l'immobilisation dense et orientée de protéines sur un film de phosphonate de zirconium. La première stratégie implique la synthèse de deux adaptateurs bifonctionnels. Pour cela, une ou deux unités NTA ont été couplées à un motif bisphosphonate pour leur immobilisation stable sur une surface de phosphonate de zirconium. Au cours de ce travail de thèse nous avons pu montrer que ces adaptateurs Mono-ou Bis-NTA permettaient de conférer au support de phosphonate de zirconium une nouvelle spécificité pour l'ancrage poly(his)6. La seconde stratégie fait intervenir la conception d'une étiquette comportant un nanocluster de quatre sérines phosphorylables par la caséine kinase II (CKII). Insérée sur la position C-terminale d'une affitine, cette étiquette s'est avérée être complètement et spécifiquement phosphorylée par la CKII in vitro. Noua avons démontré l'efficacité de cette stratégie originale basée sur l'ingénierie d'un nanocluster de phosphate pour l'immobilisation sélective des protéines sur un support de phosphonate de zirconium. Dans les deux cas, l'immobilisation dense et orientée des protéines sur un support à base de phosphonate de zirconium a été démontrée. De plus, cette nouvelle technologie permet la préparation de puces à protéines de haute qualité comparée aux supports commerciaux.