Etude biochimique des petites protéines G, Arf1 et Arf6 et de leurs facteurs d'échange ARNO et EFA6
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Abstract EN:
Arfs (ADP-ribosylation Factor)compose a family of small GTP-binding proteins involved in vesicular trafficking and actin cytoskeleton organization. As such, they cycle between two conformational state, a GDP-and a GTP-bound state. The GDP/GTP exchange is controlled by the guanine nucleotide exchange factor family, Arf-GEF. We have characterized the molecular mechanisms that control the activity of ARNO, one of these Arf- GEF. This included the measurement of the affinity of the PH and C domains of ARNO with anionic phospholipids, particularly with the phosphoinositides PIP2 and PIP3, and the demonstration and characterization of the interaction occuring between the PH domain and the bg subunits from heterotrimeric G proteins. In addition,using in vitro biochemical approaches, and with the help of the Arf6-GDP structure obtained in collaboration with Dr J. Cherfils,we have documented at the molecular level the specificity of the Arf-GEFs, ARNO and EFA6,for Arf1 and Arf6,respectively. Finally,we have tried to understand, in a cellular context, the cycle of activation of Arf6. We took advantage of our structural and molecular studies on ARF6 to design a new dominant negative ARF6 mutant,ARF6-T44N. We have demonstrated that this mutant is locked in a GTP-bound state in contrast with the first published dominant negative ARF6-T27N that we found to be in an unstable empty form. By immunofluorescence we have then precisely localized the Arf6 GDP and GTP-locked mutants and evaluated the effects of their expression on endocytosis. Altogether, our results prompted us to propose a new model for Arf6 activation and functions in situ.
Abstract FR:
Les Arfs (ADP-ribosylation Factor) forment une famille de protéines G monomériques impliquées dans les processus de transport vésiculaire et de réorganisation du cytosquelette d'actine. Comme toutes les protéines G, Elles oscillent en fonction du nucléotide associé (GDP ou GTP)entre deux états aux conformations différentes. Le passage de la forme GDP à la forme GTP est contrôlé par la famille des protéines facteurs d'échange Arf-GEF. Nous avons caractérisé les mécanismes qui contrôlent l'activité d'ARNO,un de ces Arf-GEF, et étudié le rôle de ses domaines PH et C dans l'interaction avec les phospholipides et plus particulièrement les phosphoinositides PIP2 et PIP3. Nous avons également mis en évidence et caractérisé l'interaction entre ce domaine PH et le dimère G bg des protéines G hétérotrimériques. Dans un deuxième temps, nous avons déterminé la spécificité des Arf-GEF, ARNO et EFA6 respectivement sur Arf1 et Arf6. Par des mesures biochimiques, et avec l'aide de la structure tridimensionnelle d'Arf6-GDP (en collaboration avec le Dr J. Cherfils) nous avons caractérisé au niveau moléculaire l'origine de cette spécificité. Enfin, nous avons essayé de mieux comprendre, dans un contexte cellulaire, Le cycle d'activation d'Arf6. Dans ce but, nous avons déterminé par des approches de mutagenèse dirigée les particularités d'Arf6 in vitro. Puis nous avons mis au point et caractérisé un nouveau mutant d'Arf6,Arf6-T44N, qui nous a permis de localiser dans la cellule Arf6 sous sa forme GDP. Ces analyses, couplées à de nouvelles mesures sur l'implication d'Arf6 dans l'endocytose, nous ont incités à réévaluer le modèle actuel et consensuel du cycle d'activation GDP/GTP d'Arf6.