Un nouveau concept d’analyse biologique : la PCR électrochimique en temps réel
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Abstract EN:
The aim of this work is to develop a new method for detection of the DNA amplification during the PCR. This technique based on the electrochemical signal gives to the method advantages as reliability, low cost and amenable for miniaturization in contrast to the fluorescent techniques usually used, which are expensive, bulky and fragile. First of all, we present a state of the art concerning different methods used to replicate specific sequences of DNA by enzymatic reactions which are based on fluorescent methods. In this chapter, we pay particular attention to the real time PCR and other non-optic methods of DNA detection, especially electrochemical one. The first approach developed in this work is based on the catalytic oxidation of a triphosphate nucleoside by a redox mediator. The weak reproducibility of the measures made with the couple mediator/base, Ru(bpy)32+/dGTP, is due to the high potential of oxidation of the dGTP. Nevertheless, the proof of concept is done. Another couple: Os(bpy)32+/7-deaza-dGTP, with a lower potential of oxidation, improve the performances of the method. So it is possible to detect 30 aM of viral DNA but this detection limit is about 200 times worse than the commercial kit using fluorescent probes as TaqMan™. Then a new concept was proposed based on the utilisation of an osmium-complex DNA intercalator. Results obtained showed good performances compared with TaqMan™ probes in terms as detection limit or sensitivity. These results emphasize electrochemistry as a new tool to detect DNA by real-time PCR.
Abstract FR:
Le développement d’un nouveau concept d’analyse biologique permettant de suivre en temps réel la réplication de séquences cibles d’ADN lors d’une PCR constitue l’objectif de ce travail. Nous avons envisagé le suivi de la PCR par des mesures électrochimiques, lesquelles présentent un certain nombre d’avantages (robustesse, faible coût, miniaturisation aisée,. . . ) contrairement aux méthodes commercialisées, basées sur des approches optiques. Un état de l’art sur l’amplification et la détection de fragments d’ADN sera d’abord décrit, en particulier la PCR en temps réel. Diverses méthodes non optiques de détection de l’ADN, notamment électrochimiques, seront également proposées. La première approche envisagée repose sur l’oxydation catalytique d’une base de l’ADN (dGTP) par un médiateur redox : Ru(bpy)32+. Les mesures obtenues à partir de ce couple, bien que peu reproductibles, font cependant la preuve de la faisabilité du concept. L’utilisation d’un nouveau couple : Os(bpy)32+/7-deaza-dGTP, dont le pic d’oxydation se situe à un potentiel plus bas, a permis d’améliorer les capacités de la méthode et d’atteindre une limite de détection de 30 aM. Toutefois celle-ci est environ 200 fois moins performante qu’une technique commerciale utilisant des sondes TaqMan™. Une nouvelle approche basée sur l’intercalation d’un complexe d’osmium dans le double brin de l’ADN a permis d’améliorer grandement les performances de notre PCR pour atteindre des résultats proches des techniques commerciales tant en termes de limite de détection que de sensibilité. Ces résultats démontrent ainsi l’intérêt de l’électrochimie comme nouvel outil de mesure de fragments d’ADN par PCR en temps réel.