Etude analytique de l'allergie au pollen de cyprès : aspects moléculaires et particulaires
Institution:
Paris 6Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
In the context of this study, we focused on the identification and characterization of the main allergens implicated in the cypress pollen (CP) allergy using a proteomic approach. We have developed novel detergent-based pollen protein extraction protocols in order to solubilise both hydrophilic and hydrophobic proteins from CP. One- and two-dimensional-PAGE (2-DE) immunoblotting were used for the immunochemical characterization of CP proteins using sera from cypress allergic patients living in France and Italy (n= 120). The identification of allergens was carried out by in-gel excision and tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis of 2-DE IgE binding spots. The biochemical characterization of novel allergens included determination of isoelectric points, molecular weights, the presence of bromelain-type CCD, concanavalin A–binding ability, heat stability and the degree of allergenicity under reducing and denaturing conditions. We have designed a new methodology based on double one-dimensional electrophoresis (D1-DE) for the IgE screening test of allergenic components overlapping in 1-D electrophoresis. The IgE repertoire diversity of French and Italian patients was also analyzed by using a microarray system including 103 different allergens and correlated with the established IgE immunoblot profiles. Combinatorial peptide ligand libraries (CPLL) were used for capturing the low- and very low-abundance proteins. Different eluates from the CPLL have been resolved by two-dimensional mapping, blotted and confronted with sera from cypress allergic patients. Novel low-abundant allergens were identified by using MS/MS analysis
Abstract FR:
Nos investigations se sont focalisées sur l’identification et la caractérisation des principaux allergènes impliqués dans l’allergie au pollen de cyprès. Différents protocoles d’extraction ont été développés afin de solubiliser les protéines hydrosolubles et non hydrosolubles du pollen de cyprès. L’analyse, par une approche protéomique (gel 1D, 2D et LC/MS/MS) et immunochimique grâce à 120 sérums de patients italiens et français allergiques au pollen de cyprès, nous a permis de classer les différents profils de sensibilisations IgE et d’identifier de nouvelles protéines IgE réactives dans le pollen de cyprès. La caractérisation biochimique des allergènes comprenait la détermination de leur point isoélectrique, de leur masse moléculaire, de la nature peptidique ou oligosaccharadique des épitopes reconnues ainsi que l’analyse de leurs allergénicités en conditions réductrice et dénaturante. L’adaptation de l’électrophorèse double monodimensionelle (D1-DE) à l’analyse allergomique nous a permis d’isoler de plus importantes quantités de protéine et de déterminer, par un criblage simultané d’un nombre important de sérums, la fréquence de la réactivité IgE vis-à-vis des allergènes d’intérêt. Les profils de réactivité IgE des patients italiens et français ont également été comparés en microarray sur 103 allergènes différents et corrélés aux résultats de nos immunoempreintes. La technologie d’enrichissement des protéines par des collections de ligands peptidiques nous a permis d’enrichir nos extraits de pollen en protéines moyennement ou faiblement abondantes. L’utilisation de ce nouvel outil nous a permis d’étendre considérablement le répertoire des allergènes de ce pollen