Exploration de nouveaux biomarqueurs plasmatiques pour le diagnostic de la maladie d’Alzheimer
Institution:
université Paris-SaclayDisciplines:
Directors:
Abstract EN:
The two main pathological hallmarks of Alzheimer’s disease (AD) are the formation of beta amyloid (Aβ) plaques in the brain and the formation of neurofibrillary tangles. Currently, the Aβ 1-42 peptide, which is the main component of the Aβ plaques, is avalidated biomarker of AD in the cerebrospinal fluid. Blood has been explored as an alternative matrix to quantify the Aβ 1-42 peptide, but it has not been clinically validated yet. It can be explained by the low concentration of Aβ peptidesin the blood (>0.5 nM) and by the fact that most of them (> 95%) are bound to albumin (HSA) so are not considered in the quantification of the free Aβ 1-42 peptides. In this project, we studied the potential of this hidden fraction ofthe albuminome as a source of biomarkers of AD. We first compared the performances of few ELISA based on different antibodies’ configuration to detect the intactHSA-Aβ complex in serum. The configuration which allowed the highest specific detection of the complex was the one with anti-HSA and anti-Aβ antibodies used as capture and detection antibodies respectively. Then, a solid phase extraction method was developed and allowed the extraction of the intact complex while maintaining the natural abundances of native, cysteinylated and glycated HSA (non-selective). Theselectivity, the yield of extraction (83%) and the repeatability (RSD 20 %) of the extraction method for albumin have been evaluated thanks to the development of a method in capillary electrophoresis which was able to separate and quantify the three main albumin’s isoforms. The specificity and the integrity of the extractedcomplex have been measured thanks to gel electrophoresis and ELISA. A chemical sample treatment method has been optimized to release the HSA bound Aβ peptides and an ultrasensitive ELISA (SIMOA) has been used to quantify them. Palmitic acid was the most efficient chemical treatment to release bound Aβ peptides. A low Aβ 1-42 peptides concentration in the albuminome fraction was observed in the AD’s groupcompared to the healthy subjects. All the developed methods must be employed on a larger samples’ cohort to confirm the potential of the Aβ 1-42 peptides fractionin the albuminome in the molecular diagnosis of AD.
Abstract FR:
Les deux principales caractéristiques pathologiques de la maladie d’Alzheimer (MA) sont la formation de plaques β amyloïdes (Aβ) dans le cerveau et la formation intracellulaire d’enchevêtrements neurofibrillaires. Actuellement, le peptide Aβ 1-42, constituant majoritaire des plaques Aβ, est un biomarqueur validé de la MA dans le liquide céphalo-rachidien. Le sang a aussi été envisagé comme matrice alternative mais aucun test sanguin n’a encore été cliniquement validé. Ceci peut s’expliquer par la très faible concentration du peptide Aβ 1-42 dans le sang (< 0.5 nM) mais aussi par la grande quantité de peptides Aβ (>95%) liés à l’albumine du sérumhumain (HSA) qui ne sont donc pas comptabilisés dans la quantification des peptides Aβ 1-42 libres. Dans ce projet de thèse, nous nous sommes intéressés à cette fraction cachée de l’albuminome comme source potentielle de nouveaux biomarqueurs de la MA. Nous avons tout d’abord comparé les performances de plusieurs méthodes ELISA fondées sur des configurations d'anticorps différentes afin de détecter le complexe HSA-Aβ intact dans le sérum total. La configuration qui a permis de détecter le complexe avec la plus haute spécificité est celle qui emploie des anticorps anti-HSA et anti-Aβ comme anticorps de capture et de détection respectivement. Ensuite, une méthode d’extraction sur support solide a été développée et a permis d’extraire le complexe HSAAβ intact de façon non-sélective en préservant les abondances naturelles des formes native, cystéinilée et glyquée de l’albumine. La sélectivité, le rendement (83%) et la répétabilité (CV 20%) de la méthode d’extraction pour l’albumine ont été évalués grâce au développement d’une méthode d’électrophorèse capillaire permettant de séparer et quantifier les trois principales isoformes de l’albumine. La spécificité de la méthode et le maintien de l’intégrité du complexe HSA-Aβ ont été mesurés grâce à l’électrophorèse sur gel en conditions dénaturantes et aux méthodes ELISA. Un traitement chimique d’échantillon a ensuite été optimisé pour libérer les peptides Aβ du complexe et une méthode ELISA ultrasensible (SIMOA) a été employée pour les quantifier. L’acide palmitique a pu démontrer une grande efficacité. Une plus faible concentration du peptide Aβ 1-42 issu de l’albuminome a été observée chez les patients atteints de la MA par rapport aux sujets sains. L’ensemble des méthodes développées doivent être appliquées sur une plus large cohorte d’échantillons pour confirmer le potentiel de la fraction Aβ 1-42 de l’albuminome dans le diagnostic moléculaire de la MA.