Expression chez E. Coli de protéines impliquées dans le cancer ainsi que le SIDA, et études par RMN du solide de molécules antibactériennes
Institution:
StrasbourgDisciplines:
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Abstract EN:
Membrane proteins represent 30% of human genome coding sequences. Study of the membrane proteins is limited by the difficulty to produce big quantities to perform measurement in membrane environment. We have worked on different membrane proteins during this thesis. Firstly, we have studied NK-2 peptide. This antimicrobial charged and amphipathic 27 amino acids peptide has been produced labeled with 15N in two different positions. Interaction of the peptide with oriented POPG membrane and deuterated POPC/POPGd31 vesicles has been measured by ssNMR. Our results show the peptide oriented parallel to the membrane and inserted in the lipids at about 6Å depth. We have so brought out a carpet type action model. We have also designed amino acids sequences named gp41-TM, gp120-TM and FP-TM. These proteins can expose sequences of the envelop proteins from HIV linked to a peptide TM, with the goal to produce a potential vaccine against AIDS. We have demonstrated that TM peptide takes an alpha helix structure, it oriented perpendicular to the membrane (transmembrane) and is able to form trimmers in micelles. We have developed an over expression system of these three proteins with E. Coli. Expression vectors coding for the proteins have been constructed using pTPIX4 in fusion with TAF12 protein. The proteins expressed in membrane fraction, so we have established purification protocol using delipidation of the membrane fraction before using HPLC. Finally, we have tested E. Coli expression and purification of the Bax protein in fusion with MBP, to obtain an effective method of production of this pro apoptotic protein. We have demonstrated that this system is not enough sufficient.
Abstract FR:
Les protéines membranaires représentent 30% des séquences codantes du génome humain. Ces protéines possèdent des fonctions variées. L'étude de ces protéines est limitée par la difficulté de leur production en grande quantité pour les étudier dans leur environnement membranaire. Nous avons étudié NK-2 le peptide antibactérien amphipathique et chargé de 27 acides aminés. Il a été produit marqué en 15N en deux positions dans des membranes modèles orientées de POPG, et dans des vésicules deutérées de POPC/POPG-d31. Les résultats montrent que le peptide s'oriente parallèlement à la bicouche et qu'il s'insère dans les lipides avec une profondeur de 6 Å. Nous avons pu dégager un modèle d'action de type tapis. Nous avons conçu trois séquences protéiques (gp41-TM, gp120-TM, FP-TM) qui permettent d’exposer les séquences des protéines d'enveloppe du VIH via le peptide transmembranaire TM, afin de produire un vaccin potentiel contre le VIH. Nous avons montré que TM se structure en hélice α, s'oriente transmembranaire en présence de membranes et trimérise en présence de micelles de SDS. Nous avons mis au point un système de sur-expression de ces protéines chez E. Coli: nous avons construit des vecteurs d'expression de ces protéines dans pTIPX4, avons montré que ces protéines se situaient dans les membranes. Nous avons ensuite établi un protocole de purification de la protéine FP-TM par délipidation de la fraction membranaire, et par RP-HPLC. Enfin, nous avons testé l'expression chez E. Coli et la purification de la protéine Bax en fusion avec la MBP, afin d'obtenir une méthode de production pour étudier cette protéine par RMN. Nous avons montré que ce système n'était pas assez efficace.