Effet de l'enchevêtrement et du greffage d'une enzyme sur son activité : étude sur le système pullulanase-pullulane-alginate
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Abstract EN:
The aim of this work is to study the immobilization and the enzyme activity on a functionalisable polysaccharide support. The system used is pullulanase-pullulan-alginate. The study of free pullulanase behaviour confirmed a process endo. The assay of reducing extremities and the size exclusion chromatography coupled with light scattering and refractometry allow determining all macromolecular characteristics (Mn, Mw, % maltotriose, and its multiples) during hydrolysis. The presence of alginate slows the hydrolysis kinetics of the free enzyme, in particula whe alginate concentrations are above the critical entanglement concentration (C*). The amount of oligosaccharides is not dependent on the alginate concentration and the endo enzyme behaviour is not modified by the entanglement in the medium. The covalent immobilization of pullulanase on alginate in the presence of activator was carried out via an amide bond. The immobilized enzyme retains its catalytic activity on long time and its mode of action is modified with a tendency to break preferentially the links near to the chain ends. The kinetic parameters of free pullulanase, in the presence of alginate and immobilized were determined by Isothermal Titration Calorimetry. Hydrolysis monitoring shows that the affinity of pullulanase for its substrate, pullulan is affected by the presence of alginate and its grafting.
Abstract FR:
L'objectif de ce travail est d'étudier ld greffage et l'activité d'une enzyme sur un support polysaccharide fonctionnalisable. Le système modèle utilisé est pullulanase-pullulane-alginate. L'étude du mode de fonctionnement de la pullulanase libre a confirmé un processus enzymatique en mode endo. Le dosage colorimétrique des extrémités réductrices et la chromatographie d'exclusion stérique couplée à la diffusion de la lumière et la réfractométrie permettent l'accès à l'ensemble des caractéristiques macromoléculaires (Mn, Mw, % maltotriose et ses multiples) pendant l'hydrolyse. La présence d'alginate ralentit la cinétique d'hydrolyse de l'enzyme libre, notamment pour des concentrations en alginate supérieures à la consentration critique d'enchevêtrement (C*). La quantité d'oligosaccharides produits n'est pas dépendante de la concentration en alginate et le mode de fonctionnement endo de l'enzyme n'apparaît pas modifié par l'enchevêtrement dans le milieu. Le greffage covalent de la pullulanase sur l'alginate en présence d'activateur a été réalisé via une liaison amide. L'enzyme immobilisée conserve ses fonctions catalytiques sur des temps beaucoup plus longs et le mode d'action de l'enzyme immobilisée est modifié avec une tendance à rompre préférentiellement les liaisons plus proches des extrémités de chaînes. Les paramètres cinétiques de la pullulanase libre, en présence d'alginate et greffée ont été déterminés par Isothermal Titration Calorimetry. Le suivi des hydrolyses montre que l'affinité de la pullulanase pour son substrat, le pullulane est affectée par la présence d'alginate et par son greffage.