Plateforme microfluidique d’optimisation de biocatalyseurs pour des biopiles à combustible
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Abstract EN:
To cope with the dramatic decline of fossil fuels and natural resources, different types of biofuel cell have been developed and optimized. These systems are capable of converting chemical energy into electrical energy from renewable resources by biological catalysts. The two major problems which limit their application are the small amount of power they generate and their short-lived. Our goal is to build a functional biofuel cell using enzymes as redox catalysts at the anode (Pyrrolo-Quinone-Quinone-alcool déshydrogénases, PQQ-ADH) and the cathode (laccase). To achieve this goal the key points are a high catalytic activity of these enzymes at high ethanol concentrations, broad pH and temperature variations and their stability at the interface with the electrodes. These are conditions under which the natural enzyme will never evolve in vivo. Hence, we are aiming to apply in vitro protein evolution methods in combination with digital microfluidics to create better catalysts for the “green energy” production. Digital microfluidics is a novel and promising high-throughput screening technique which can emulsify samples in droplets of a volume as small as ~1pL. These tiny droplets can mimic artificial cells allowing expressing the genes of interest and test for their enzymatic activity. Even more important, digital microfluidics allows droplets fusion, content mixing, incubations, signal detection and sorting of positives variants separately. In addition, with being a very powerful high-throughput technique, our approach will procure an unprecedented level of control over the directed evolution experiments. For a successful evolution of ADH and laccase using digital microfluidics, the following challenges need to be addressed (before performing directed evolution of the catalysts): 1. Synthesis and detailed characterisation of surfactants used in digital microfluidic experiments (emulsion stability, leakage and biological compatibility). 2. Creation of a reliable microfluidic chip allowing to detect and sort the droplets containing highly active biocatalysts. 3. Controling the leakage of compounds between droplets. 4. Optimisation of the recovery strategy selected variants and validate its relevance with a model selection of PQQ-ADH.
Abstract FR:
Pour faire face à la baisse considérable des énergies fossiles et des ressources naturelles, différents types de biopiles à combustible ont été développés et optimisés. Ces systèmes sont capables de convertir l’énergie chimique en énergie électrique à partir de ressources renouvelables grâce à des catalyseurs biologiques. Les deux problèmes majeurs des biopiles sont les faibles puissances qu’elles génèrent et leur courte durée de vie. Afin de résoudre ces problèmes et augmenter les performances des biopiles, la plupart des travaux de recherche se sont principalement axés sur le développement de nouvelles stratégies pour améliorer le transfert d’électrons ainsi que sur l’optimisation des méthodes d’immobilisation des enzymes sur les électrodes. Nous pensons que l’évolution dirigée des biocatalyseurs par des cycles répétitifs de mutagenèse/sélection permettrait d’augmenter leur activité dans ce nouvel environnement que constitue la biopile. Pour la création de la banque de variants, la stratégie choisie est l’introduction de mutations artificielles et aléatoires dans le gène codant pour la protéine d’intérêt. Pour la sélection des enzymes optimisées, nous avons choisi la technique de la compartimentation in vitro (IVC) couplée à la microfluidique, développée au sein de notre laboratoire. Cette méthode permet de créer des gouttes d’eau-dans-huile de taille homogène, de les manipuler à volonté, de détecter la fluorescence de leur contenu et de les trier en se basant sur cette fluorescence afin de récupérer le variant désiré. Mon projet de thèse consiste à créer, par évolution dirigée, des biocatalyseurs spécialement adaptés à fonctionner dans les conditions de fonctionnement de biopile. Pour le compartiment anodique, nous avons choisi de tester et d’optimiser différentes Pyrrolo-Quinone-Quinone-alcool déshydrogénases (PQQ- ADH) réalisant l’oxydation de l’éthanol en acide acétique. Une fois les électrons transférés au compartiment cathodique, une laccase bactérienne extrêmophile se charge de la réduction du dioxygène en eau. Le passage des électrons vers la cathode génère un courant proportionnel aux taux de catalyse au niveau des électrodes. Pour la mesure de l’activité de ces enzymes cathodique et anodique en goutte, deux tests fluorogéniques différents ont été développés. Pour les PQQ-ADH, le test s’est basé sur la réduction d’une molécule fluorogénique (la résazurine) pour produire un fluorophore (la résorufine) une fois que l’éthanol est oxydé en acide acétique par les enzymes. Par la suite, nous avons développé et optimisé deux plateformes microfluidiques de sélection des biocatalyseurs anodique et cathodique. L’une permet de sélectionner les enzymes exprimées in vitro en gouttes et l’autre de sélectionner les enzymes exprimées in vivo en gouttes. Mes travaux de thèse se sont focalisés, essentiellement sur le développement de la plateforme microfluidique de sélection des PQQ-ADH exprimée in vivo et plus précisément sur le contrôle des échanges de composés entre les gouttes, le choix du tensioactif adapté au test, la stratégie de récupération des variants sélectionnés et la validation de sa pertinence avec une sélection modèle utilisant les PQQ-ADH.