Mise au point de dosages immunologiques du Saquinavir et du ddATP et leurs applications cliniques
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Abstract EN:
Highly active antiretroviral therapy (HAART) dramatically improves rates of mortality and morbility due to HIV infections. Unfortunately, clinical failures are observed partly due to inefficient cellular concentration of drug enable to suppress the viral load. The determination of intracellular contents of drugs in targets cells should be contributed to optimize the antiviral treatment by a therapeutic drug monitoring (TDM). In this order we developed highly specific and sensitive immunological techniques directed against the Saquinavir (SQV) and against the active metabolite of ddI, the ddATP. The anti-SQV antibodies were characterized using two sensitive immunological methods (ELISA and RIA) allowing the quantification of plasma and cellular contents of HIV patients. For the quantification of ddATP, we developed two immunological approaches. The first one named “indirect” method, use the ddA as hapten. Then, the determination of the ddI phosphorylated metabolites contents are performed after purification and dephosphorylation of biological samples. The second one, named “direct” approach, use the ddATP molecule and an isostère of ddATP as haptens? The isostère molecule was selected on structural and electronic analogies basis between the ddATP and the isostère molecules. The anti-ddATP, the anti-isostere and anti-ddA antibodies were characterized using the same radioactive probe. The specificity study of anti-isostere antibodies allows us to conclude that the substitution of pyrophosphate by citrate moiety is a useful alternative to produce antibodies against phosphorylated molecules. The ddATP radioimmunoassay was used to determine in an in vitro model (peripheral blood mononuclear cells) the intracellular contents of all the phosphorylated forms of ddA (ddAMP, ddADP and ddATP). The ddI plasma content and the dd AMP, ddATP and ddATP intracellular contents were measured in five patients infected by HIV and treated by polythérapie.
Abstract FR:
Les polythérapies anti-VIH (HAART) ont considérablement amélioré la survie des patients, mais ont vu émerger des phénomènes d’échappement thérapeutiques, probablement dus à des concentrations intracellulaires de la molécule antivirale insuffisantes. Un des moyens d’appréhender l’échappement thérapeutique pourrait être la détermination de la concentration des molécules antivirales dans les cellules cibles. Ainsi, nous avons développé des techniques de dosages immunologiques sensibles et spécifiques pour le Saquinavir et pour le métabolite actif de la ddI, le ddATP. Pour le Saquinavir (SQV), nous avons produit des anticorps dirigés directement contre la molécule administrée. Ces anticorps ont été caractérisés par deux tests immunologiques (ELISA et RIA) possédant une sensibilité suffisante pour permettre la quantification plasmatique et cellulaire du SQV dans les échantillons biologiques. Pour le ddATP, nous avons développé deux approches. La première, dite « indirecte » a consisté à produire des anticorps dirigés contre le motif commun à tous les métabolites phosphorylés de la ddI, c’est-à-dire la ddA. Une approche « directe » a consisté à produire des anticorps dirigés contre la ddATP en utilisant soit le ddATP soit une molécule isostère du ddATP. La sélection de la molécule isostère a été basée sur des analogies structurale et électronique entre les deux molécules. Les anticorps anti-ddA, anti-ddATP et anti-isostère du ddATP ont été caractérisés en RIA. L’étude de la spécificité des anticorps anti-isostère du ddATP montre que le chaînon citrate est un bon substituant du chaînon pyrophosphate pour la production d’anticorps dirigés contre une molécule triphosphorylée. Les anticorps anti-isostère du ddATP ont été utilisés pour le dosage « direct » du ddATP et le dosage « indirect » des métabolites phosphorylés de la ddA après séparation su cartouche anionique puis déphosphorylation. Les dosages immunologiques du SQV et du ddATP ont été validés sur un modèle cellulaire in vitro utilisant des cellules monocytaires circulantes. Ils nous ont également permis de déterminer les taux plasmatiques de SQV et de ddI chez des patients ainsi que la quantification cellulaire du ddAMP, du ddADP et du dd ATP chez cinq patients en polythérapie.