Voies de sauvetage du pool des pyrimidines et du NAD : des alliés inattendus dans le maintien de la stabilité du génome
Institution:
Paris Sciences et Lettres (ComUE)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Bloom syndrome (BS) is a rare human autosomal recessive disorder resulting from mutations in both copies of the BLM gene, encoding BLM, a 3’-5’ RecQ DNA helicase. BS cells present a strong genetic instability and BS patients are predisposed to a wide range of cancers that commonly affect the general population. BLM depletion leads to the downregulation of cytidine deaminase (CDA), an enzyme of the pyrimidine salvage pathway that catalyzes the hydrolytic deamination of cytidine (C) and deoxycytidine (dC) to uridine (U) and deoxyuridine (U), respectively. CDA defect leads to an excess of cellular dC and deoxycytidine triphosphate (dCTP) in either BS cells or BLM-expressing cells, that jeopardizes genome stability. Indeed, this nucleotide pool disequilibrium leads to a significant reduction of basal Poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) activity. The resulting low levels of PARP-1 activity disturb Chk1 activation and decrease the efficiency of downstream checkpoints, leading to the accumulation, during mitosis, of unreplicated DNA at some “difficult-to-replicate” loci in the genome, such as centromeres, fragile sites, leading to excess ultrafine anaphase bridge (UFB) formation. The objective of my PhD project was to decipher the mechanism leading to the reduction of basal PARP-1 activity in the absence of CDA. We performed a metabolomic study that revealed an increase in nicotinamide (NAM) levels, the substrate of nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT), and a decrease in nicotinamide mononucleotide (NMN) levels, the product of NAMPT. We confirmed the reduction of the nuclear NAMPT activity in CDA-deficient cells. We found that the siRNA-mediated NAMPT knockdown or the chemical NAMPT inhibition reproduce the reduction of basal PARP-1 activity in CDA-proficient cells, but not in CDA-deficient cells. Moreover, expression of exogenous wild type NAMPT, but not of the NAMPT catalytic mutant, fully rescued the reduction of basal PARP1 activity, and the subsequent increase in UFB frequency in CDA-deficient cells. These results indicate that the reduced basal PARP-1 activity in CDA-deficient cells is due to a reduced NAMPT activity. We propose a model in which the intracellular accumulation of dC/dCTP resulting from CDA deficiency might impair the nuclear NAMPT activity, resulting in an intracellular accumulation of NAM, a known natural inhibitor of PARP-1, that consequently reduces PARP-1 activity. Our results highlight for the first time a link between cytidine deaminase deficiency and nicotinamide metabolism, a pathway essential for the maintenance of cell integrity.
Abstract FR:
Le syndrome de Bloom (SB) est une maladie humaine autosomique récessive rare résultant d’une mutation sur les deux copies du gène BLM, qui code pour la protéine BLM, une 3’-5’ ADN hélicase de la sous-famille recQ. Les cellules SB présentent une forte instabilité génétique et les patients atteints du SB sont prédisposés au développement de tous les types de cancers affectant la population générale. La déplétion en BLM conduit à une chute drastique de l’expression de la cytidine désaminase (CDA), une enzyme de la voie de sauvetage des pyrimidines qui catalyse la désamination hydrolytique de la cytidine (C) et de la désoxycytidine (dC) en uridine (U) et désoxyuridine (dU). La déficience en CDA conduit à un excès de dC et de dCTP (désoxycytidine triphosphate) dans les cellules SB, mais également dans les cellules qui expriment BLM, ce qui entraîne une instabilité génétique. Effectivement, ce déséquilibre du pool de pyrimidines conduit à une diminution significative de l’activité basale de la poly (ADP-ribose) polymérase 1 (PARP-1) qui, elle-même, entraîne une réduction de l’activation de Chk1. Ceci affaiblit l‘efficacité des points de contrôle du cycle cellulaire en aval, favorisant l’accumulation en mitose de séquences d’ADN non répliquées qui conduisent à une formation excessive de ponts anaphasiques ultrafins (UFB). Ces séquences concernent essentiellement des régions du génome « difficiles à répliquer », comme les centromères et les sites fragiles. L’objectif de mon projet thèse était de décrypter le mécanisme conduisant à la réduction de l’activité basale de PARP-1 dans les cellules déficientes en CDA. Nous avons effectué une étude comparative des métabolomes de deux couples de lignées isogéniques exprimant ou non CDA qui a révélé une augmentation du niveau de nicotinamide (NAM), substrat de la nicotinamide phosphoribosyltransférase (NAMPT), et une diminution du niveau de nicotinamide mononucléotide (NMN), produit de la NAMPT, dans les cellules déficientes en CDA. Nous avons confirmé la réduction de l’activité de la NAMPT nucléaire dans les cellules déficientes en CDA. Nous avons également montré que la déplétion en NAMPT par ARN interférence ou l’inhibition chimique de l’activité de la NAMPT reproduit la réduction de l’activité basale de PARP-1 dans les cellules exprimant CDA, et pas dans les cellules déficientes en CDA. De plus, l’expression exogène de la NAMPT sauvage, mais pas celle de la NAMPT mutée dans son site catalytique, restaure complètement l’activité basale de PARP-1 dans les cellules déficientes en CDA, entraînant de fait une normalisation de la fréquence des UFBs dans ces cellules. Ces résultats indiquent que la réduction de l’activité basale de PARP-1 dans les cellules déficientes en CDA résulte de la diminution de l’activité de la NAMPT. Nous proposons un modèle dans lequel l’accumulation intracellulaire de dC /dCTP résultant de la déficience en CDA pourrait entraver l’activité de la NAMPT nucléaire, provoquant une accumulation intracellulaire de NAM, un inhibiteur naturel connu de PARP-1, qui par conséquent réduirait l'activité basale de PARP-1. Nos résultats révèlent pour la première fois, un lien entre la déficience en CDA et le métabolisme du nicotinamide, voie métabolique essentielle pour le maintien de l’intégrité de la cellule.