Interplay Between the Two DNA Binding Domains of BRCA2
Institution:
université Paris-SaclayDisciplines:
Directors:
Abstract EN:
Germline mutations in the BRCA2 gene predispose to increased risk of breast and ovarian cancer. BRCA2 is one of the key mediators of Homologous Recombination (HR), the pathway that most accurately repairs DNA double-strand breaks (DSBs). BRCA2 is also involved in protecting stalled replication forks from excessive nucleolytic degradation by MRE11. BRCA2 contains a DNA binding domain at the C-terminus (CTD). Interestingly, our laboratory recently reported a novel DNA binding site in the N-terminus (NTD). The NTD binds both ssDNA and dsDNA however what are the functions of both DNA binding domains in the context of the full-length protein and in the cell remains unclear. We hypothesized that these two DNA binding domains of BRCA2 may have evolved to repair specific types of DNA damage. To test this hypothesis, we generated human stable cell lines expressing BRCA2 variants identified in breast cancer patients altering the DNA binding activity of the canonical CTD or the NTD. We then used functional assays to characterize their phenotype in the context of DSB repair and replication stress. We demonstrated that, in contrast to the CTD variant bearing cells, cells expressing the NTD variants are HR proficient and, accordingly, they are not sensitive to PARP inhibitor treatment. Interestingly, we observed an increased sensitivity to replication stress in cells expressing NTD variants, which was not observed in cells expressing the CTD variant. Moreover, using in situ proximity ligation assay we showed that BRCA2 is recruited to active and HU-stalled replication forks and cells expressing BRCA2 NTD variants display a defect in localization of both BRCA2 and RAD51 to the forks. In contrast, cells expressing CTD variant exhibits no defect in BRCA2 recruitment and mild defect in RAD51 localization. Interestingly, only the cells expressing NTD variants accumulate ssDNA gaps after HU induced Replication stress. Our data strongly suggest that BRCA2 CTD domain is required for the HR (Double-strand break repair) and that the NTD is involved in the replication stress response and prevention of ssDNA gap accumulation that could ultimately lead to genomic instability.
Abstract FR:
Les mutations germinales du gène BRCA2 entrainent des prédispositions aux cancers du sein et de l’ovaire. BRCA2 est un médiateur clé de la Recombinaison Homologue (HR), la voie de réparation la plus précise des cassures double-brins (DSBs) de l’ADN. BRCA2 est aussi impliqué dans la protection des fourches de réplication bloquées, empêchant une dégradation nucléolytique excessive par MRE11. BRCA2 comporte un domaine de liaison à l’ADN dans sa région C-terminale (CTD). Notre laboratoire a récemment mis en évidence un autre domaine de liaison à l’ADN situé dans la région N-terminale (NTD). Le NTD lie aussi bien les ADN simple-brins que les double-brins. Cependant, les fonctions distinctes du CTD et du NTD dans le contexte de la protéine complète et dans les cellules restent indéterminées. Nous avons émis l’hypothèse que ces deux domaines de liaison à l’ADN pouvaient avoir, au cours de l’évolution, acquis des spécificités pour la réparation de certains types de dommages à l’ADN. Afin de tester cette hypothèse, nous avons généré des lignées cellulaires humaines stables exprimant des variants de BRCA2 identifiés dans des patientes atteintes d’un cancer du sein et altérant la capacité de liaison à l’ADN du CTD ou du NTD. Nous avons utilisé des tests fonctionnels pour caractériser leurs phénotypes dans un contexte de réparation de DSB et de stress réplicatif. Nous avons démontré que, contrairement aux cellules portant des variants CTD, les cellules exprimant des variants NTD sont compétentes pour la HR et, par conséquent, ne sont pas sensibles aux traitements inhibiteurs de PARP. Nous avons observé que les cellules exprimant des variants NTD montraient une sensibilité plus importante au stress réplicatif, phénotype qui n’est pas observable pour les cellules exprimant des variants du CTD. De plus, par des expériences de proximity ligation assay in situ, nous avons démontré que BRCA2 est recruté aux fourches de réplication actives ou bloquées par le traitement HU et que les cellules exprimant les variants NTD exposent un défaut dans la localisation de BRCA2 et RAD51 aux fourches. En opposition, les cellules exprimant des variants CTD ne montrent aucun défaut dans le recrutement de BRCA2 et un léger effet sur la localisation de RAD51. Seules les cellules exprimant des variants NTD accumulent des ssDNA gaps dans des conditions de stress réplicatif induit par un traitement HU. Nos résultats suggèrent fortement que le domaine CTD de BRCA2 est requis pour la HR (réparation des cassures double-brins) et que le NTD est impliqué dans la réponse au stress réplicatif dans la prévention de l’accumulation de ssDNA gaps qui pourrait être responsable d’instabilité génomique.