Origins of Cellular Lethality Resulting From a Defect in Homologous Recombination in Human Cells
Institution:
université Paris-SaclayDisciplines:
Directors:
Abstract EN:
Homologous recombination (HR) is involved in repairing DNA double strand breaks, and in protecting and restarting stalled or collapsed replication forks. Rad51 and BRCA2 are two key proteins of HR. I have showed that inhibiting HR, as well as over expressing Rad51, is lethal in human cells, although a very few cells still survive the inhibition. Moreover, many cancers carry mutations in an HR gene (BRCA1/2 in breast and ovary cancers) or over express an HR gene. My project aims to identify the mechanisms and the causes behind the lethality triggered by a dysregulation of HR, and to understand how a few cells manage to survive it. I have determined, through FACS and phosphorylated histone H3 labeling (IF), that HR deficient human cells, or those over expressing Rad51, accumulate at the G2/M checkpoint.At the same time, time-lapse microscopy experiments seemed to indicate that the cells died from apoptosis, which was confirmed by data from experiments using Annexin-V as an apoptosis marker and from Western-Blots. Western-Blots showed that the G2/M checkpoint is activated, through analysis of CyclinB1 and of cdk1, and that apoptosis is triggered, through analysis of PARP cleavage. My main working hypothesis was that overexpressing a dominant negative form of Rad51, and possibly also overexpressing Rad51 WT, would lead to replication defects, whose accumulation would in turn lead to an activation of the checkpoint. BrdU incorporation experients and use of the molecular combing technique confirmed this hypothesis : in HR-dysregulated cells, replication speed is slowed down and there are more stalled forks. In-silico analyses have showed that HR-mutated cancers often carry a second mutation in another gene, involved in either the G2/M checkpoint or in restarting stalled replication forks. Based on these analyses and on results from RNAseq experiments performed on FANCD1 patients' fibroblasts, candidate genes have already been listed, confirming the in-silico analysis.
Abstract FR:
La recombinaison homologue (RH) est impliquée dans la réparation des cassures double brin à l'ADN, et dans la gestion des fourches de réplication bloquées. Rad51 et BRCA2 en sont deux protéines pivots.J'ai montré que l'inhibition de la RH ainsi que la surexpression de Rad51 sont létales dans les cellules humaines, mais qu'un faible nombre de cellules arrivent à survivre. De plus, dans plusieurs cancers, les gènes de la RH sont mutés (BRCA1/2 dans les cancers du sein et de l'ovaire) ou la surexpression d'un gène de la RH est observée. Mon projet a pour but d'identifier les mécanismes et les causes de la létalité induite par une dérégulation de la RH dans les cellules humaines, ainsi que de comprendre comment certaines cellules arrivent à y survivre. L’analyse du cycle cellulaire et du marquage Histone H3 phosphorylée a révélé que les cellules humaines inactivées pour la RH ou surexprimant RAD51 s’accumulent à la transition G2/M. Parallèlement la vidéomicroscopie a suggéré que les cellules mourraient par apoptose, ce qui a été corroboré par des expériences utilisant l'Annexin-V comme marqueur d’apoptose et par des Western-Blot. Les Western Blots montrent que le checkpoint G2/M est activé, via l'analyse de la cyclineB1 et de cdk1, et que l'apoptose est déclenchée, via l'analyse du clivage de PARP. Mon hypothèse principale de travail étant que la surexpression d'un dominant négatif de Rad51 et possiblement la surexpression du Rad51 WT, entraîne des défauts de réplication dont l'accumulation entraînerait une activation du checkpoint. Des expériences d'incorporation de BrdU et de peignage moléculaire sont venus confirmer mon hypothèse : dans les cellules ayant une dérégulation de la RH, la vitesse de réplication est diminuée et il y a plus de fourches bloquées. Des analyses in-silico ont révélées que les cancers mutés dans la RH sont fréquemment co-mutés dans des gènes impliqués dans le checkpoint G2/M ou dans le redémarrage des fourches. Une liste de gènes candidats, enrichie de résultats de séquençages de fibroblastes de patients FANCD1, a été testée, confirmant l'analyse in-silico.