Mise au point et application de la technologie FALI (Fluorophore-Assisted Light Inactivation) à l'étude de moteurs moléculaires
Institution:
Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
To improve our capacity to analyze the role of multifonctional proteins involved in the cellular division, we decided to develop the FALI technology (Fluorophore-Assisted Light Inactivation). The principle of FALI is to tag a fluorophore to a protein of interest. The controlled illumination of this fluorophore allows the production of free radicals which denature specifically and locally the tagged protein. To develop and to validate this technology we developed two approaches: a method in which we overexpress a protein tagged with a fluorophore (FlAsH reagent), and a method where the fluorophore (FITC or FlAsH) is brought by a single-chain antibody (ScFv). We thus confirmed the implication of ZW10 protein in the transport of Golgi fragments, showing also that we manage to develop FALI. We also could show for the first time the implication of LIS1 protein in this same mechanism. Our first FALI experiments to study the fast poleward movement of chromosomes mediated by dynein in U2OS cells could not be carried out because of the too great toxicity of the labeling. These experiments show the importance to test the toxicity of the biarsenical ligands for each cell line and each protein we want to study.
Abstract FR:
Dans le but d’améliorer notre capacité à analyser le rôle de protéines multifonctionnelles impliquées dans la division cellulaire, nous avons entrepris de développer la technologie FALI (Fluorophore-Assisted Light Inactivation). Le principe de FALI est de coupler un fluorophore à une protéine d’intérêt. L’illumination contrôlée de ce fluorophore permet la production de radicaux libres qui dénaturent spécifiquement et localement la protéine taguée. Pour mettre au point et valider cette technologie nous avons développé deux approches : une méthode directe par surexpression de protéines taguées avec un fluorophore (réactifs FlAsH/ReAsH), et une méthode indirecte où le fluorophore (FITC ou FlAsH/ReAsH) est apporté par un anticorps single-chain (ScFv). Nous avons ainsi confirmé l’implication de la protéine ZW10 dans le transport des vésicules golgiennes, montrant par la même occasion que nous parvenons à faire FALI. Nous avons également pu montrer pour la première fois l’implication de la protéine LIS1 dans ce même mécanisme. Nos premières tentatives de FALI dans les cellules U2OS sur l’étude du mouvement rapide des chromosomes médié par la dynéine n’ont pu être effectués du fait de la trop grande toxicité de la méthode de marquage. Ces expériences nous ont appris l’importance de tester pour chaque lignée cellulaire et chaque protéine étudiée, la toxicité de la méthode de marquage par les ligands biarseniques.