Implication du facteur de transcription Net dans la réponse à l'hypoxie
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Hypoxia is defined as an inadequate oxygen supply to the cells and tissues of the body. This condition is known to occur during embryonic development, wound healing, vascular and pulmonary diseases and cancers. Indeed, a solid tumour is characterized by a rapid cellular expansion that quickly outpaces the ability of the tumour to create new blood vessels, resulting in a hypoxic microenvironment within the tumour. The cellular response to hypoxia involves the induction of the transcription factor HIF-1a (Hypoxia Inducible Factor-1a). In normal conditions (normoxia) HIF-1a is hydroxylated by the oxygen “sensors”: the Prolyl-4-Hydroxylases containing-domains (PHDs), and degraded by the proteasome. Under hypoxic conditions, hydroxylated HIF-1a is stabilized, and induces the expression of target genes involved in the hypoxic response. Fifteen years ago, Dr. Wasylyk’s lab identified the transcription factor Net as a new protein belonging to the Ets transcription factors family. These are nuclear effectors of the Ras-MAP kinase signalling pathway, constitutively active in most cancers. Net, is a member of the TCF (Ternary Complex Factor) subfamily with Elk-1 and Sap-1a. It is a strong repressor of transcription but is converted to a positive regulator by phosphorylation by MAP kinases. Net is involved in cell proliferation, cell migration, angiogenesis and tumorigenesis, three processes also known to be regulated by hypoxia. In hypoxia, Net is polyubiquitylated and degraded by the proteasome. So in contrast to HIF-1a, Net is degraded in hypoxia. A large-scale analysis of RNA expression using microarrays, allowed us to identify new normoxia- and hypoxia-specific target genes. Interestingly, the majority of genes induced in hypoxia required both the factors Net and HIF-1a, suggesting that the functions of these factors are closely linked and that both factors could belong to the same regulatory pathway. Indeed, Net regulates the expression of at least three genes known to control HIF-1a stability. These results suggest that Net participates in the transcriptional response to hypoxia via regulation of HIF-1a protein stability. The mechanism, however, by which hypoxia regulates Net activity remains to be elucidate. We have shown that both overexpression and downregulation of the PHDs have an effect on Net stability. Furthermore, Net interacts with PHD1, PHD3 in normoxia whereas it interacts with PHD1, PHD2 and PHD3 in late hypoxia. The interaction of PHD2 with Net seems to be indirect, and mediated by HIF-1a. These results indicate that both, HIF-1a and Net bind to PHDs. Moreover, an in vitro hydroxylation assay suggests that Net, like HIF-1a, can be hydroxylated by these enzymes. To confirm these data, mass spectrometry experiments were started. Factors involved in the HIF-1a regulatory pathway and HIF-1a itself, are targets for new therapeutic strategies in cancer research. Therefore, the understanding of mechanisms involved in this pathway and, in particular the discovery of novel actors involved in this, pathway is of great interest.
Abstract FR:
L’hypoxie est une diminution localisée, au sein d’un tissu, de la concentration en oxygène. L’hypoxie se produit pendant le développement embryonnaire, le processus de cicatrisation, mais également au cours de maladies vasculaires aigues et chroniques, de maladies pulmonaires ou de cancers. En effet, une tumeur solide est caractérisée par une croissance cellulaire rapide. L’apport en oxygène devient alors insuffisant ce qui va générer un environnement hypoxique au sein de la tumeur. La voie de réponse cellulaire à l’hypoxie passe par l’induction du facteur de transcription HIF-1a (Hypoxia Inducible Factor-1a). En conditions normales en oxygène (normoxie) HIF-1a est hydroxylé par les « senseurs » de l’oxygène : les Prolyl-4-Hydroxylases containing-domains (PHDs), puis est dégradé par le protéasome. En hypoxie, HIF-1a non hydroxylé est alors stabilisé et induit l’expression de nombreux gènes cibles importants pour la réponse cellulaire à l’hypoxie. Il y a une quinzaine d’années, le laboratoire du Dr. Wasylyk a identifié un nouveau facteur de transcription de la famille Ets, effecteurs de la voie Ras, constitutivement active dans beaucoup de cancers : le facteur Net. Net appartient à la sous-famille des TCFs (Ternary Complex Factor) avec Elk-1 et Sap-1a. Net est un puissant répresseur transcriptionnel convertible en activateur après phosphorylation par les MAPK. Net est impliqué dans la prolifération cellulaire, la migration cellulaire, l’angiogenèse et la tumorigenèse, qui sont des processus clés induits par l’hypoxie. En hypoxie, le facteur Net est polyubiquitiné et dégradé par le protéasome. Contrairement à HIF-1a, Net est donc dégradé en hypoxie. Une analyse transcriptomique à large échelle, a permis d’identifier de nouveaux gènes cibles de Net en normoxie d’une part et en hypoxie d’autre part. De plus dans notre étude la grande majorité des gènes induits en hypoxie nécessite les deux facteurs, Net et HIF-1a, ce qui suggère que les fonctions de ces deux facteurs sont liées, et qu’ils pourraient être impliqués dans la même voie de régulation. En effet, Net régule l’expression d’au moins trois facteurs qui sont connus pour être d’importants régulateurs de la stabilité de HIF-1a. Net participe donc à la réponse transcriptionnelle hypoxique. Mais les mécanismes de sa régulation en hypoxie restent à élucider. La surexpression et l’inhibition des PHDs ont un effet sur la stabilité de Net. De plus, Net interagit avec PHD1 et PHD3 en normoxie et avec PHD1, PHD3 mais également PHD2 en hypoxie, via son interaction avec HIF-1a. Tout comme HIF-1a, Net pourrait donc être un substrat des PHDs. Des résultats d’ « hydroxylation assay » suggèrent que Net pourrait être, comme HIF-1a, hydroxylé par ces enzymes. Pour confirmer ces résultats des analyses de spectrométrie de masse ont été lancées. Les facteurs impliqués dans la voie de régulation de HIF-1a, et HIF-1a lui-même, sont des cibles thérapeutiques anticancéreuses actuelles. C’est pourquoi la compréhension des mécanismes impliqués dans sa voie de régulation et notamment l’identification de nouveaux effecteurs appartenant à cette voie sont d’un grand intérêt.