Nouvelles stratégies de vectorisation non virale impliquant des détergents cationiques : Caractérisation physicochimique et devenir intracellulaire des complexes vecteurs/ADN
Institution:
Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
The success of gene therapy depends on the development of vectors able to efficiency deliver therapeutic gene into target cells. For in vivo applications, the size and the stability of vector/DNA complexes are key determinants for an efficient blood diffusion and intracellular trafficking. Within this framework, new synthetic vectors combining properties of cationic detergents and lipids were synthesized in the laboratory of J. P Behr. In spite of their favourable monomolecular DNA condensing properties, the transfection efficiency of these vectors was limited. In this context, in order to study the structure-activity relationship of these vectors, we have characterized the physicochemical properties of DNA complexed with dimerizable cationic detergents. By fluorescence spectroscopy, we have investigated their ability to condense DNA, the molecular order of the hydrophobic domains, and the stability of these complexes. Indeed, a minimal hydrocarbon tail length is required to stabilize the complexes. Moreover, a tight relationship between the stability of these complexes and their transfection efficiency was established. Based on these results, we have prepared new ternary complexes combining cationic liposomes and cationic detergents to DNA. By this strategy, we have formed small and stable ternary complexes. In the presence of serum, their transfection efficiency was higher than lipoplexes. Confocal microscopy observations suggested that ternary complexes were only marginally destabilized by serum and efficiently internalized into cells by endocytosis. Structural studies by electron microscopy and fluorescence spectroscopy associated with the monitoring of intracellular trafficking revealed that the internal lamellar organization of the complexes was strongly correlated with their colloidal stability and their high transfection efficiency in the presence of serum.
Abstract FR:
Le succès de la thérapie génique repose sur la mise au point de vecteurs capables de délivrer efficacement le gène d'intérêt thérapeutique dans la cellule cible. Dans le cadre d'un transfert de gènes in vivo, la taille et la stabilité des complexes vecteurs/ADN sont des facteurs déterminants pour une bonne diffusion dans les milieux extracellulaire et intracellulaire. De ce fait, de nouveaux vecteurs synthétiques combinant les détergents cationiques et lipides cationiques ont été synthétisés dans le laboratoire du Dr. J. P Behr. Cependant, malgré des propriétés favorables de condensation monomoléculaire de l'ADN, ces vecteurs présentent des efficacités de transfection variables et limitées. Dans ce contexte, afin d'étudier les relations structure-activité de ces vecteurs, nous avons caractérisé les propriétés physicochimiques de complexes entre l'ADN et des vecteurs de la classe des détergents cationiques dimérisables. Par spectroscopie de fluorescence, nous avons montré que la capacité à condenser l'ADN, le degré de structuration des domaines hydrophobes ainsi que la stabilité des complexes formés étaient étroitement corrélés aux propriétés structurales des détergents. Ainsi, une longueur minimale de la chaîne hydrocarbonée des détergents est requise pour stabiliser les complexes. De même, une relation entre la stabilité des complexes et leur efficacité de transfection a été établie. L'ensemble de ces résultats nous a conduit à préparer de nouveaux complexes ternaires combinant des liposomes cationiques et des détergents cationiques avec l'ADN. Par cette approche, nous avons formé des complexes ternaires de petite taille et stables. En présence de sérum, leur efficacité de transfection s'est révélée supérieure à celle des lipoplexes. Des observations par microscopie confocale suggèrent que les complexes ternaires ne sont pas déstabilisés par le sérum et sont efficacement endocytosés par la cellule. Les études structurales par microscopie électronique et spectroscopie de fluorescence combinées au suivi du devenir intracellulaire des complexes ternaires, nous ont permis de corréler l'organisation lamellaire des complexes avec leur stabilité colloi͏̈dale en présence de sérum et leur efficacité de transfection cellulaire.