Identification of target genes of the Nodal pathway using array analysis of complex probes
Institution:
Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Nodal signalling plays a crucial role during germ layer formation in the vertebrate embryo. To identify target genes of the Nodal pathway in the zebrafish, I have established a subtractive cloning approach. Quantitative analysis of the subtracted probe pools using macroarrays that contain a normalised cDNA library led to the identification of 132 genes enriched by activation of the Nodal pathway. Among these genes are proteins involved in cellular metabolism and the cytoskeleton, which suggests an important role for this signalling pathway in cell physiology during gastrulation. Further genes identified include molecules implicated in different signalling pathways as well as transcription factors. I studied more in detail one of these factors, a novel sox gene family member, and demonstrated that it is disrupted in the casanova mutant which is blocked in a crucial step of endoderm development. Other genes cloned are the anti-dorsalizing morphogenetic protein, a BMP family member implicated in organizer formation, and the helix-loop-helix gene id3. A similar approach was applied to identify genes specifically expressed in the notochord and the floor plate of the neural tube, the formation of which depends on Nodal signalling in the zebrafish. Cells were isolated from embryos expressing GFP under the control of tissue specific promoters and a pool of clones enriched in notochord and floor plate specific genes was obtained. More than 650 clones have been tested for expression using a robot-aided in situ approach, allowing the identification of coexpression groups, including a notochord/floor plate/hypochord group comprising enzymes involved in the collagen synthesis and maturation pathway.
Abstract FR:
La voie de signalisation Nodal joue un rôle clé au cours de la formation des feuillets germinaux chez l'embryon des vertébrés. Afin d'identifier des gènes cible de la voie Nodal chez le poisson-zèbre, j'ai mis au point une méthode de clonage par soustraction. L'analyse quantitative des sondes complexes soustraits utilisant des macro-grilles d'une banque d'ADNc normalisée a permis d'identifier 132 gènes enrichis par l'activation de la voie Nodal. Parmi ces gènes se trouvent des protéines ayant un rôle dans le métabolisme cellulaire et dans le cytosquelette, ce qui suggère un rôle majeur de cette voie dans la physiologie cellulaire au cours de la gastrulation. S'y trouvent aussi des molécules impliqués dans différentes voies de signalisation, ainsi que des facteurs de transcription. J'ai étudié plus en détail l'un de ces facteurs, un nouveau membre de la famille des gènes sox, et je l'ai identifié comme étant le gène touché par la mutation casanova, indispensable à la formation de l'endoderme. D'autres gènes ont été clonés, comme par exemple l'anti-dorsalizing morphogenetic protein, un membre de la famille des BMPs impliqué dans la formation du centre organisateur embryonnaire, et le gène de la famille hélice-boucle-hélice id3. Un principe similaire a été appliqué pour identifier des gènes exprimés spécifiquement dans la notochorde et la plaque du plancher du tube neural, dont la formation chez le poisson-zèbre dépend de Nodal. A partir de deux lignées transgéniques, j'ai isolé deux populations de cellules différentes de part leur expression de la GFP, puis appliqué la méthode de clonage par soustraction. 650 clones ont été isolés et analysés par hybridation in situ robotisée. J'ai ainsi défini plusieurs groupes de synexpression, par exemple une groupe exprimée dans la notochorde/floor plate/hypochorde constituée de gènes impliqués dans la biosynthèse et la maturation du collagène.