Analyse de la fonction de la protéine humaine ICBP90 et l'étude de son rôle dans la régulation de la transcription du gène de la topoisomérase II α humaine : Etudes in vitro et dans les cellules en culture
Institution:
Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Topoisomerases are ubiquitous, highly conserved enzymes : they catalyse the interconversion of topological forms of DNA and participate in the procedures which implicate the double helix. The a isoform (topoIIa) is essential to the cell survival. In normal cells, the protein is a marker of cell division since its expression is low during the G0/G1 phase and high during mitosis. This regulation is altered in cancer cells, in which the enzyme is overexpressed. Thus, the topoIIa is a primary target for widely used anticancer drugs. Nevertheless, modifications of the gene expression could lead to 'resistance' phenomena to these treatments. ICBP90 (Inverted CCAAT box Binding Protein of 90kDa) is capable of interact with the ICB2 box of the human topoIIa (htopoIIa) gene promoter and could be involved in the mechanisms controlling the regulation of this promoter. To answer that issue, we studied at first the expression profile of endogenous ICBP90, in cancer tissue. These studies, combined to experiments of cultured cells synchronization by serum starvation, showed that the regulation of ICBP90 was cell-cycle dependent, induced during the G0/G1 phase transition and deregulated in cancer. These findings being consistent with a role of the protein in the regulation of the htopoIIa gene expression, we transiently transfected cultured cells with recombinant DNA containing the reporter gene CAT, but also performed in vitro transcription experiments. After a partial characterization of the htopoIIa gene promoter, we have shown that the ICBP90 overexpression was responsible of a decrease of its activity. On the contrary, an increase of the HSVtk promoter activity was observed. In addition to that, we used two different techniques in order to decrease the endogenous ICBP90 protein quantity: HeLa cells transfection experiments using a specific siRNA ('small interfering RNA'), showed that the decrease in the protein expression was accompanied by a decrease of that of the htopoIIa but not of that of lamin A/C, ß-actin and the majority of nuclear proteins. Finally, we performed a first step towards the use of the monoclonal antibody directed against ICBP90 (IRC1C10) in therapeutic goals : the Fab fragment of this antibody has been cloned, expressed in E. Coli and purified from the cultured medium.
Abstract FR:
Les topoisomérases sont des enzymes ubiquitaires, hautement conservées : elles catalysent l'interconversion des formes topologiques de l'ADN et participent aux processus impliquant la double hélice. L'isoforme a (topoIIa) est essentielle à la survie cellulaire. Dans les cellules normales, la protéine est un marqueur de division cellulaire car son expression est faible pendant les phases G0/G1 et forte pendant la mitose. Cette régulation est altérée dans les cellules cancéreuses dans lesquelles l'enzyme est surexprimée. Ainsi, la topoIIa est une cible primaire des drogues anti-cancéreuses couramment utilisées. Cependant, des modifications de l'expression du gène peuvent être la cause de phénomènes de 'résistance' à ces traitements. ICBP90 (Inverted CCAAT box Binding Protein of 90kDa) est capable d' interagir avec la boîte ICB2 du promoteur du gène de la topoIIa humaine (topoIIah) et serait potentiellement impliquée dans les mécanismes qui contrôlent la régulation de ce promoteur. Pour répondre à cette question, nous avons dans un premier temps étudié le profil d'expression de l'ICBP90 endogène dans du tissu cancéreux. Ces études, combinées à des expériences de synchronisation par privation de sérum de cellules en culture, ont montré que la régulation de l'expression d'ICBP90 était dépendante du cycle cellulaire, induite lors de la transition G1/S et dérégulée dans les cancers. Ce schéma étant en accord avec un rôle de la protéine dans la régulation de l'expression du gène de la topoIIah, nous avons réalisé des transfections transitoires de cellules en culture par de l'ADN recombinant contenant le gène rapporteur CAT, mais aussi des expériences de transcription in vitro. Après avoir caractérisé partiellement le promoteur de la topoIIah, nous avons montré que la surexpression d'ICBP90 était responsable d'une diminution de l'activité de ce dernier et d'une augmentation de celui du HSVtk. Nous avons également utilisé deux techniques différentes pour diminuer la quantité d'ICBP90 endogène: la transfection des cellules HeLa par un siRNA ('small interfering RNA') spécifique, a montré que la diminution de la quantité de cette protéine est accompagnée de celle de topoIIah mais non de celle de la lamine A/C, de la ß-actine et de la grande majorité des protéines nucléaires. Enfin, nous avons réalisé un premier pas vers l'utilisation de l'anticorps monoclonal dirigé contre l'ICBP90 (1RC1C10) à des buts thérapeutiques : ainsi le fragment Fab de cet anticorps a été cloné, exprimé dans E. Coli et purifié à partir du surnageant de culture.