Etude des relations structure-fonction de l'arginyl-ARNt synthétase et de l'ARNtarg de Saccharomyces cerevisiae à l'aide d'approches génétiques
Institution:
Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
The work presented in this manuscript is a study of the structure-activity relationships of the arginyl-tRNA synthetase (ArgRS) and tRNA arginine (tRNAArg) from Saccharomyces cerevisiae. We employed cellular and biochemical methods of investigation. Using original genetic screens, we isolated mutants of ArgRS and tRNAArg having lost their functionality in vivo. Then, the kinetic properties of the mutants of ArgRS were analyzed in vitro while the expression and the level of aminoacylation of tRNAArg variants were analyzed in vivo. The study of the ArgRS made it possible to identify two regions essential for the enzymatic activity. In the first region, which corresponds to the catalytic core, we characterized a set of residues implied in the binding of ATP, arginine and the acceptrice end of tRNAArg. In a second region, located at the carboxy-terminal end, we identified the binding site of the tRNAArg anticodon. The modification of this site disturbs the reaction of activation of the arginine and induces a drop of the affinity for the ATP, which shows the interconnection of the binding sites of ATP and tRNAArg. The study of the tRNAArg made it possible to highlight the essential role of a certain number of nucleotides located in the dihydroU loop and in the anticodon loop. We showed that the expression and the stability of the tRNA depend on the integrity of the nucleotides from the dihydroU loop while the nucleotides from the anticodon loop are essential for the interaction with the components of the translation machinery. Lastly, the nucleotides of positions 35 and 36 of the anticodon are determining for the recognition by the ArgRS. The nucleotide of position 20 is also essential but only in the context of tRNAArg2ICG.
Abstract FR:
Les recherches présentées dans ce mémoire ont porté sur les relations structure-activité de l'arginyl-ARNt synthétase (ArgRS) et de l'ARNt arginine (ARNtArg) de Saccharomyces cerevisiae. Nous avons employé des méthodes d'investigation à la fois cellulaires et biochimiques. À l'aide de cribles génétiques originaux, nous avons isolé des mutants d'ArgRS et d'ARNtArg ayant perdu leur fonctionnalité in vivo. Puis, les propriétés cinétiques des mutants d'ArgRS ont été analysées in vitro tandis que l'expression et le niveau d'aminoacylation des ARNtArg mutés ont été analysés in vivo. L'étude portant sur l'ArgRS a permis d'identifier deux domaines essentiels à l'activité enzymatique. Dans le premier domaine, qui correspond au cœur catalytique, nous avons caractérisé un ensemble de résidus impliqués dans la fixation de l'ATP, de l'arginine et de l'extrémité acceptrice de l'ARNtArg. Dans un second domaine, situé à l'extrémité carboxy-terminale, nous avons localisé le site de fixation de l'anticodon de l'ARNtArg. La modification de ce site perturbe à distance la réaction d'activation de l'arginine et induit des chutes d'affinité pour l'ATP, ce qui démontre l'interconnexion des sites de fixation de l'ATP et de l'ARNtArg. L'étude portant sur l'ARNtArg a permis de mettre en évidence le rôle essentiel d'un certain nombre de nucléotides localisés dans la boucle du dihydroU et dans la boucle de l'anticodon. Nous avons montré que l'expression et la stabilité de l'ARNt dépendaient de l'intégrité des nucléotides de la boucle du dihydroU tandis que les nucléotides de la boucle de l'anticodon étaient essentiels pour l'interaction avec les composants de la machinerie de traduction. Enfin, les nucléotides des positions 35 et 36 de l'anticodon sont déterminants pour la reconnaissance par l'ArgRS. Le nucléotide de la position 20 est également essentiel mais uniquement dans le contexte de l'ARNtArg2ICG.