Régulation de la voie de biosynthèse des isoprénoi͏̈des cytoplasmiques chez le tabac
Institution:
Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
The first part of this work is a study of the involvement of the 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR) and squalene synthase (SQS) in sterol homeostasis in tobacco BY-2 cells. As an approach, we used compounds able either to inhibit the sterol biosynthetic pathway in the endoplasmic reticulum or to remove sterols from the plasma membrane. The results indicate that SQS is not involved in regulation of the biosynthetic flux leading to sterols, under our conditions. In contrast, HMGR expression is shown to be dependent on the position of the inhibited step in the biosynthetic pathway. The inhibition of SQS and squalene epoxidase, the two first enzymes, triggers a positive compensatory response of the HMGR. But inhibition of downstream steps (14-demethylation of obtusifoliol) induces a decrease in enzyme activity. In the case of a selective sterol depletion from the plasma membrane, no compensatory response of HMGR is observed, suggesting that the end products would not be " sensed " any longer by the enzyme, after their incorporation into the plasma membrane. The second part of the work is devoted to the cloning and preliminary characterization of two tobacco acetoacetyl-CoA thiolases, AACT-1 and AACT-2. Experiences of virus-induced gene silencing, in vivo localization of GFP-fused proteins and spatiotemporal expression of both genes demonstrate that these two AACT have distinct intracellular localizations and functions. AACT-1 is clearly a soluble enzyme involved in the biosynthesis of cytosolic isoprenoids. AACT-2 is specifically associated with peroxisomes and might play a role in the b-oxidation of fatty acids.
Abstract FR:
La première partie de ce travail est consacrée à la détermination des rôles respectifs de la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A réductase (HMGR) et de la squalène synthase (SQS) dans l'homéostasie des stérols de cellules de tabac BY-2. L'approche utilisée a été l'utilisation de composés capables d'inhiber la biosynthèse des stérols libres au niveau du reticulum endoplasmique ou de diminuer la teneur en stérols de la membrane plasmique. Les résultats obtenus indiquent que, dans toutes les conditions utilisées, la SQS n'intervient pas dans la régulation du flux biosynthétique conduisant aux stérols. Par contre, l'expression de l'HMGR dépend directement de la position de l'étape inhibée dans la chaîne de biosynthèse. L'inhibition des deux premières enzymes, la SQS et la squalène époxydase, induit une réponse compensatoire positive de l'HMGR. Mais l'inhibition d'étapes situées plus en aval (déméthylation en 14 de l'obtusifoliol), entraîne une baisse d'activité de l'enzyme. Dans le cas d'une déplétion sélective des stérols de la membrane plasmique, aucune réponse compensatoire de l'HMGR n'est induite, suggérant que les produits de fin de chaîne, une fois incorporés dans la membrane plasmique, ne seraient plus capables d'être des effecteurs de l'enzyme. Le second volet de la thèse traite du clonage et de la caractérisation préliminaire de deux acétoacétyl-CoA thiolases de tabac, AACT-1 et AACT-2. La réalisation d'expériences de " virus induced gene silencing ", de localisation in vivo de protéines fusionnées à la GFP ainsi qu'une étude spatio-temporelle de l'expression des deux gènes ont permis de démontrer que ces deux AACT ont des localisations intracellulaires et des fonctions différentes. L'AACT-1 est clairement une enzyme soluble, qui participe à la synthèse des isoprénoi͏̈des cytosoliques. Par contre, l'AACT-2 est associée spécifiquement aux peroxysomes, où elle pourrait jouer un rôle dans l'étape terminale de la b-oxydation des acides gras.