Rôles fonctionnels des Poly(ADP-ribose)polymérases -1, -2 et de leur activité dans le contrôle épigénétique de la prolifération et de la différenciation cellulaire
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Abstract EN:
Poly(ADP-ribosyl)ation is a post-translational modification of proteins catalyzed by Poly(ADP-ribose)polymerases (Parps), a large family of 17 proteins. To determine the in vivo functions of Parp1 and Parp2, Parp1-/- and Parp2-/- mice were generated and revealed both redundant and more specific functions of both Parps in genome integrity. More recently, the lab identified male hypofertility in Parp2 deficient mice associated with impaired spermatogenesis and defects in both meiosis and spermiogenesis (differentiation of spermatids to spermatozoa). To further investigate the function of Parp2 in germ cell differentiation, we performed electronic microscopy studies in Parp2-/-spermatids and identified a delay in chromatin condensation that can be explained by an impaired replacement of histones by transition proteins (TP1 and TP2). Using in vitro and ex vivo binding assays, we identified a protein complex containing Parp2, Parp1, TP2 and its chaperon HSPA2 that is regulated by Parp1 activity. Our work suggests a role of this complex and Parp activity in chromatin structure during spermiogenesis. The identification of Parp2 specific partners by mass spectrometry revealed an interaction of Parp2 with the transcriptional intermediary factor TIF1! which presents functional similarities with Parp2. Using biochemical, molecular and cellular approaches, we identified a physical and functional interaction between Parp1 and Parp2 with TIF1! and HP1 heterochromatic structural proteins which is required for the differentiation of F9 cells into primitive and parietal endoderm like cells. Whereas Parp2 and its activity are necessary for the differentiation of F9 cells into primitive endoderm like cells by targeting TIF1! to heterochromatic foci, Parp1 and its activity regulate TIF1!–HP1" interaction and control the terminal F9 differentiation into parietal endoderm like cells. Altogether our results describe the involvement of Parp2, Parp1 and Parp activity in the control of pericentric heterochromatin structure through the regulation of the HP1 mediated silencing subcode. In order to highlight the role of both Parps in the pericentric heterochromatin structure, we currently analyze its dynamic during DNA replication. We identify an involvement of Parp1, Parp2 and their activity in S phase progression, when pericentric heterochromatin is replicated. Protein-protein interaction studies with two major chromatin binding proteins : HP1s chaperon CAF-1 and Dnmt1 (DNA methyl-transferase 1) partner Np95 were also initiated. Our first results show the requirement of Parp2 and its activity in CAF-1 recruitment onto pericentric heterochromatin replication foci. In contrast, the relocation of Np95 to these foci is not affected by the absence of Parps or their activities. Finally, we show that Parp1 interacts and poly(ADP-ribosyl)ates Np95 on its SRA domain, which is required for hemi-methylated DNA binding.
Abstract FR:
La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle des protéines catalysée par les Poly(ADPribose)polymérases (Parps) qui constituent une famille de 17 membres. Afin de caractériser les rôles in vivo de Parp1 et de Parp2, des souris déficientes en chacune de ces protéines ont été générées et révèlent des fonctions à la fois redondantes et spécifiques de ces deux Parps dans la maintenance de la stabilité génomique. Les souris mâles déficientes en Parp2 présentent un phénotype spécifique d’hypofertilité associée à une dérégulation du processus de spermatogenèse dans les étapes de méiose et de différenciation des spermatides en spermatozoïdes (spermiogenèse). Afin de caractériser la fonction de Parp2 au cours de la spermatogenèse, des études de microscopie électronique à transmission ont été réalisées et montrent un délai de condensation de la chromatine dans les spermatides issus de souris Parp2-/- qui peut s'expliquer par un défaut de remplacement des histones par les protéines de transition (TP1 et TP2). Des études d’interaction in vitro et ex vivo mettent en évidence un complexe protéique composé de Parp2, Parp1, TP2 et sa protéine chaperonne HSPA2 régulé par l’activité de poly(ADP-ribosyl)ation de Parp1. Nos données suggèrent un rôle de ce complexe et de l’activité Parp dans la structure de la chromatine au cours de la spermiogenèse. La recherche de partenaires potentiels de Parp2 par spectrométrie de masse a permis l'identification du régulateur transcriptionnel TIF1! (Facteur de Transcription Intermédiaire 1!) qui présente un grand nombre de similitudes fonctionnelles avec Parp2. En combinant des approches biochimique, moléculaire et cellulaire, nous avons mis en évidence une interaction physique et fonctionnelle de Parp1 et Parp2 avec TIF1! et les protéines de structure de l’hétérochromatine HP1s, qui intervient dans la différenciation des cellules de carcinome embryonnaire F9 en cellules type endoderme primitif et pariétal. Tandis que Parp2 et son activité catalytique sont requises pour la relocalisation de TIF1! au niveau de l'hétérochromatine péricentrique lors de la différenciation en cellules type endoderme primitif, Parp1 et la poly(ADPribosyl) ation modulent l'interaction entre TIF1! et HP1", indispensable pour la différenciation en cellules type endoderme pariétal. De plus, ces travaux suggèrent un rôle de ce complexe et de l’activité Parp dans la modulation de la structure de l’hétérochromatine péricentrique au travers du sous-code histone médié par les protéines HP1s. De façon à éclaircir le rôle des deux Parps dans la structure de l’hétérochromatine péricentrique, nous nous sommes intéressées à sa dynamique au cours de la réplication. Nous montrons un impact de l’absence des Parps et de leur activité dans la progression de la phase S au moment de la réplication de l’hétérochromatine péricentrique. Des études biochimiques d’interaction protéique ont été initiées avec les protéines majeures de son reformation : la protéine chaperonne des HP1s, CAF-1 et le facteur recruteur de l’ADN-méthyltransférase 1 (Dnmt1), Np95. Nos résultats préliminaires identifient un rôle de Parp2 et de son activité dans le recrutement de CAF-1 sur les foyers de réplication de l’hétérochromatine péricentrique tandis que la localisation de Np95 n’est pas affectée. Nous montrons aussi que Parp1 interagit et poly(ADP-ribosyl)e Np95 sur son domaine SRA, nécessaire à la liaison avec l’ADN hémi-méthylé,