Profil de recombinaison, genèse et étude fonctionnelle des recombinants VIH-1/MO : à la frontière de nouvelles espèces de VIH
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Abstract EN:
Recombination plays a major role in HIV evolution and amplifies their extraordinary HIV diversity. HIV-1 group O (HIV-1/O) are rare variants that are mostly found in Cameroon, where they are endemic. Due to a high genetic divergence between HIV-1/O and the major group, HIV-1/M, recombination between them had been first thought impossible. Nevertheless, in regions where HIV-1/M and HIV-1/O co-circulate, HIV-1/M+O dual infections have been described, leading in some cases to the emergence of HIV-1/MO recombinants, reminiscent of HIV-1/M unique recombinant forms (URFs). To date, ten URF-MO have been characterised in Cameroon and one in France. Due to scarce data, little is known regarding the mechanisms underlying their generation their transmissibility and how they can establish a sustainable infection in patients. In the first part of this work, we investigated the rules governing their generation during reverse transcription through a singe-cycle recombination assay in the first half of the HIV-1 coding sequence. We found out that they were similar to those described for HIV-1/M intra-group recombinants: the sequence identity between the parental strains was the first parameter driving MO recombination, but was clearly not sufficient to predict the breakpoints positions. RNA structures, mostly guiding recombination at genes borders, were thought to be the second parameter involved. We also showed that most of breakpoints were found at the same location for several M/O crossings, while few of them were isolate-specific. We also confirmed the vpr gene was a recombination hot spot, as previously suspected for the forms found in patients. Thanks to a the surveillance of HIV-1 genetic diversity, led by the French National Reference Centre for HIV, we were also able to characterise eight news forms or putative forms in France, suspected through serological dual reactivity, sero-molecular or molecular discrepancies, occurring upon diagnosis or monitoring. With the data gathered in Cameroon and in France, we were able to compare the breakpoints found in vivo with the mapping carried out in cellulo, and found out that they mostly cluster in four regions, three of which are described as hot spots with the single-cycle assay. Using a functional analysis, we investigated the impact of a breakpoints shared by three unrelated chimeras and located outside a recombination hot spot, at the protease/RT border. We found out that a [GagPR-M/RTIN-O] pattern was in favour of URF-MO emergence, while the specular pattern showed mild to strong defects in virion maturation depending on isolates. By investigating this non-specular phenotype, we further demonstrated that capsid is a major barrier to MO inter-group recombination, with a strong impairment of reverse transcription observed when replacing an M capsid by several different heterologous O counterparts. The opposite pattern (CA-M in an HIV-1/O isolate) led to variable phenotypes at the reverse transcription and post-reverse transcription level, suggesting pleiotropic effects. At last, by a thorough study of recombination patterns in the LTRs, according to the number of breakpoints found in the HIV coding sequence, we also revisited the reverse transcription process, and demonstrated that the recombinants generated in LTRs by the strong stops mostly occur during [+] strand strong stop transfer, due to a particular structure in the PBS. In conclusion, this work allowed characterising 8 new URF-MO, leading to a current total of 19 distinct forms, and showing the plasticity of HIV evolution by recombination between highly divergent strains. It also provided new insights in the mechanisms of generation of these forms, showing that the rules defined for intra-group recombination could be extended to inter-group recombinants and that the emergence of recombinants rely on complex coevolution networks, probably partially strain-dependent.
Abstract FR:
La recombinaison joue un rôle majeur dans l’évolution des VIH et amplifie leur extraordinaire diversité génétique. Les VIH de groupe O (VIH-1/O) sont des variants rares, endémiques au Cameroun, et présentant une grande divergence avec les VIH de groupe (VIH-1/M), le groupe majeur de VIH. Longtemps pensée impossible, la présence de recombinaison entre ces deux groupes a été démontrée dans les régions où ils co-circulent, les recombinants MO décrits, rappelant les formes recombinantes uniques (URFs) du VIH-1/M. A ce jour, dix URFMO ont été caractérisées au Cameroun et une en France. Le peu de données disponibles les concernant ne permet actuellement pas d’avoir une bonne connaissance des mécanismes régissant leur génération, leur transmission et leur émergence chez le patient. Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié les règles gouvernant leur génération pendant la transcription inverse grâce à une cartographie de la recombinaison sur la première moitié de la séquence codante du VIH-1. Il ressort que ces règles sont similaires à celles décrites pour les recombinants intra-groupe M : l’identité de séquence entre les souches parentales est le paramètre majeur mais n’est clairement pas suffisante pour prédire l’ensemble des points de recombinaison (ou de cassure). Les structures secondaires de l’ARN génomique, guidant principalement la recombinaison au niveau des bordures des gènes, semble être le second paramètre impliqué. Nous avons également montré que la plupart des points de cassure sont retrouvés au même endroit quels que soient les couples d’isolats utilisés et confirmé que le gène vpr était un point chaud de recombinaison, comme cela avait déjà été suggéré in vivo. Grâce au système de surveillance de la diversité des VIH-1 mis en place par le Centre National de Référence pour le VIH, nous avons également caractérisé huit nouvelles formes ou formes putatives en France, suspectées grâce à une double réactivité M+O au sérotypage, de discordances séro-moléculaires ou entre les différents tests moléculaires, survenant lors du diagnostic ou du suivi des patients. La synthèse des données camerounaises et françaises sur les points de cassure montre qu’ils sont retrouvés dans quatre zones, dont trois décrites comme zones chaudes par la cartographie in cellulo. Troisièmement, nous avons étudié l’impact sur la fonctionnalité virale du point de cassure situé dans une zone non prédite par la cartographie, mais retrouvé chez trois URFMO, à la jonction entre la protéase et la transcriptase inverse. Les résultats indiquent qu’un profil [GagPR-M/RTIN-O] est très en faveur de l’émergence d’une URF-MO alors que le profil inverse entraîne des défauts de maturation plus ou moins sévères selon les isolats utilisés. L’investigation de ce défaut a montré que la capside était une barrière majeure pour la recombinaison MO, avec une inhibition de la transcription inverse lors qu’une capside M est remplacée par une capside O, quels que soient les isolats utilisés. Le profil inverse (CA-M dans un contexte O) donne des phénotypes plus contrastés au niveau de la transcription inverse ou des étapes ultérieures, suggérant des effets pléïotropiques. Enfin, un biais observé entre le nombre de points de cassure dans la région codante et la présence ou non d’un point de cassure dans les LTRs entre U3 et R nous a conduit à revisiter le processus de transcription inverse et à montrer que les recombinants générés dans les LTRs par les sauts obligatoires de matrice étaient produits lors du transfert du brin [+], guidé par la présence d’une séquence palindromique située dans le PBS. En conclusion, ce travail a permis de caractériser 8 nouvelles URF-MO, menant à un total de 19 formes distinctes et montrant la plasticité de l’évolution des VIH par recombinaison entre des souches très divergentes. Il a également permis de préciser les mécanismes menant à leur génération, de montrer que les règles régissant la recombinaison intra-groupe pouvaient être étendues à la recombinaison inter-groupe et que l’émergence des URF-MO reposait sur des réseaux complexes de coévolution, partiellement dépendants des souches parentales.