Clonage et expression d'un nouveau cytochrome P450 végétal catalysant l'oxydation des acides gras
Institution:
Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
The aim of this work was to isolate and sequence microsomal cytochrome P450s from Vicia sativa involved in omega-oxidation of fatty acids. We have developed a new method to radioactively label P450s using selective mechanism-based inhibitors targeted to these P450 isolation. Thus, it is possible during protein isolation to follow the radioactive inactivated enzyme, rather than enzyme activity in reconstituted preparations, which greatly aids the P450 isolation. A partially purified preparation of P450s from clofibrate-induced Vicia sativa seedlings containing omega-hydroxylation activities for lauric and oleic acids was obtained. Incubation of a reconstituted preparation with [1-14C]11-dodecynoic acid resulted in a labelling of at least two proteins (about 53 kDa). One of the labelled porteins, detected by X-ray film exposure, was isolated by successive SDS-PAGE analysis and subjected to “in gel” V8 proteolysis. After transferring peptides generated by proteolysis from the gel to an Immobilon membrane and sequencing the peptides, the amino acid sequence of an internal peptide fragment from the hemoprotein was characterized. Using the deduced PCR primers, a specific nucleotide probe was produced by RT-PCR from clofibrate-induced V. Sativa seedling RNA. Screening the corresponding cDNA library isolated a full length cDNA clone (VAGH111) containing the conserved heme-binding region of P450 genes. According to the criteria established by Nebert et al. (less than 40% identity within P450 gene families), VAGH111 was classified as a member of a new P450 family, CYP94A1. The clone CYP94A1 was expressed in a yeast strain overexpressing its own NADPH-cytochrome P450 reductase. Studies of the substrate specificity show that this expressed P450 primarily catalyzes the oxidation of lauric and myristic acids. Although, long-chain fatty acids from C16 and C18 families can ben hydroxylated by the P450 but with 5 times less efficiency than the preferred substrates.
Abstract FR:
Le but de ce travail était d’isoler et de séquencer des P450s microsomiques de vesce impliqués dans l’oméga-oxydation des acides gras. Nous avons développé une nouvelle méthode de marquage chimique des P450s par des inhibiteurs sélectifs basés sur le mécanisme catalytique qui inactivent les activités de ces P450s. La possibilité de suivre la radioactivité des enzymes alkylées, au lieu de leur activité reconstituée, est un avantage pour isoler ces P450s. Nous avons reconstitué les activités oméga-hydroxylases des acides laurique et oléique avec une préparation partiellement purifiée en P450 à partir des microsomes de plantules de vesce traitées par le clofibrate. Une incubation avec cette préparation et du [1-14C]11-DDYA montre un marquage d’un moins deux protéines (PM environ 53 kDa). Une de ces protéines marquées, détectée par auroradiographie, a été isolée par une suite d’électrophorèses et hydrolysée directement dans un gel par la protéase V8. Après transfert des peptides sur une membrane d’Immobilon, une séquence interne de cette hémoprotéine a été obtenue. En utilisant des oligonucléotides dégénérés correspondant à la séquence peptidique spécifique, nous avons amplifié par RT-PCR sur des ARNs de plantules de vesce induites par le clofibrate un fragment spécifique. Par criblage d’une banque d’ADNc correspondant, nous avons isolés un clone complet (VAGH111) qui comporte le domaine conservé chez tous les cytochromes P450s correspondant à la zone de fixation de l’hème. Le comité de nomenclature (Nebert et al. ) (moins de 40% d’identité en acides aminés avec tous les cytochromes P450) a classé VAGH111 dans une nouvelle famille et l’a nommé CYP94A1. Le clone CYP94A1 a été exprimé dans une souche de levure surexprimant sa propre NADPH-cytochrome P450 réducatase. Des études de spécificité de substrats montrent que les vitesses de métabolisation des acides laurique et myristique sont 5 fois supérieures à celles des acides palmitique, oléiques et linoléique.