A structural approach to the role of 7SK snRNA in the regulation of eukaryotic transcription
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Abstract EN:
7SK is a non-coding RNA present in the nucleus of metazoans. Together with the HEXIM1 protein, 7SK sequesters and inhibits the kinase activity of the Positive Transcription Elongation Factor, P-TEFb. P-TEFb stimulates the productive elongation by releasing the RNA polymerase II from the promoter-proximal pausing. The association of 7SK to different protein partners may play a key role in the regulation of the RNAPII transcription. We identified and characterized the structural determinants in 7SK for its interaction with its protein partners, and in particular with HEXIM1. SHAPE and SAXS studies suggested that 7SK is a semi-compact, flexible and modular molecule. Three structural, autonomous subdomains were identified. One of them, HP1 (nucleotides 24 to 87), binds to HEXIM1. NMR mapping showed that the ARM of HEXIM1 is able to specifically bind the conserved GAUC repeated motif in the apical region of HP1. The bulged Us encompassing this motif have an essential role in the recognition. Upon the binding, the GAUC motif stem opens and the base pair A39/G68 is formed. Using EMSA, we found that mutations of the GAUC motif, of the bulged Us or of the internal loop in the middle region of HP1, highly impair the binding to HEXIM1, whereas mutations in the basal stem region do not affect the interaction. Our investigation by MS showed that the HEXIM1 binds preferentially HP1 as a dimer. Using a monomer HEXIM, we found that two monomers interact with HP1. These results support the existence of a second binding site in HP1, close to the GAUC motif. Further work needs to be done to establish the precise location of this second binding site.
Abstract FR:
7SK est un ARN non-codant présent dans le noyau des métazoaires. Avec la protéine HEXIM1, 7SK séquestre et inhibe l'activité kinase du facteur d'élongation de transcription, P-TEFb. P-TEFb stimule l'élongation productive de l'ARN polymérase II. L'association de 7SK à différents partenaires protéiques peut jouer un rôle clé dans la régulation de la transcription. Nous avons identifié et caractérisé les déterminants structurels de 7SK pour son interaction avec ses partenaires protéiques, et en particulier avec HEXIM1. Des études SHAPE et SAXS ont suggéré que 7SK est une molécule semi-compact, flexible et modulaire. Trois sous-domaines structurels autonomes ont été identifiés. L'un d'eux, HP1 (nucléotides 24 à 87), interagit avec HEXIM1. Une cartographie par RMN a montré que l’ARM de HEXIM1 est capable de lier spécifiquement le motif GAUC conservé dans la région apicale de HP1. Les Us extrudées qui bordent ce motif ont un rôle essentiel dans la reconnaissance. Lors de la liaison, la tige comprenant le motif GAUC s'ouvre et la paire de base A39/G68 est formée. Nous avons constaté par des expériences EMSAs que des mutations du motif GAUC, des Us extrudées ou de la boucle interne dans la région centrale de HP1, nuisent à la liaison à HEXIM1, alors que les mutations dans la région basale de la tige n'affectent pas l'interaction. Des expériences MS ont montré que HEXIM1 lie HP1 sous forme de dimère. En utilisant une HEXIM monomère, nous avons constaté que deux monomères interagissent avec HP1. Ces résultats confirment l'existence d'un deuxième site de liaison de HP1, dont l'emplacement précis reste encore à déterminer.