Ratiometric fluorophores for peptides and oligonucleotides labeling : application to the HIV-1 nucleocapsid protein
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This work focuses on the development of a methodology for sensing interactions of proteins with oligonucleotides (ODNs) and membranes based on fluorescent probes from the 3-hydroxychromone (3HC) family. Due to an excited state intramolecular proton transfer, these dyes exhibit two highly resolved emission bands, differently sensitive to the environment, thus allowing to sense interactions through their intensity ratio changes. An amino acid analogue based on 3HC was synthesized and inserted at selected positions of the HIV-1nucleocapsid protein (NC), to further characterize the peptide-ODNs interaction and provide site-specific information on the environmental changes induced by the interaction close to the labeling site. As an alternative, fluorescent nucleosides were synthesized and applied to different positions of ODNs. To study the peptide-membrane interactions, 3HC probe sensitive to polarity changes in apolar solvents was coupled to the N-terminus of melittin, magainin and poly-L-lysine peptides, known to interact with lipid membranes. The observed intensity ratio of the probe correlates well with the insertion depth of the N-terminal region of the peptides. Finally, we applied this dye for the detection of possible interactions of NC with membranes. We have shown that NC binds with high affinity to membranes containing negatively charged lipids. This interaction is mainly driven by electrostatic forces and locates NC at the level of lipid heads. Moreover, NC destabilizes the membrane in a concentration-dependent manner. As free NC, NC-DNA complexes can also bind to membranes, suggesting an involvement of NC in the nuclear import of the pre-integration complex.
Abstract FR:
Ce travail porte sur le développement de sondes fluorescentes 3-hydroxychromones pour suivre l’interaction de protéines avec des oligonucléotides (ODNs) et des membranes. Ces sondes ont deux bandes d'émission bien séparées et sensibles à l'environnement, résultant d’un transfert de proton intramoléculaire à l’état excité, d’où une détection des interactions via leur rapport d'intensité. Un analogue d’acide aminé dérivé de la sonde 3HC a été synthétisé puis inséré à des positions ciblées de la protéine de la nucléocapside (NC) du VIH-1. Nous avons ainsi obtenus des informations site-spécifique sur les modifications induites à proximité du site marqué lors de l’interaction avec des ODNs, une alternative étant d’utiliser des nucléosides fluorescents introduits en différentes positions des ODNs. Pour étudier les interactions peptide-membrane, une sonde 3HC sensible aux changements de polarité en solvants apolaires a été couplée à l’extrémité N-terminale de peptides synthétiques (mélittine, magaïnine, poly-L-lysine) connus pour interagir avec les biomembranes. Le rapport d'intensité se corréle bien avec la profondeur d'insertion de cette région N-terminale. Enfin, nous avons appliqué cette sonde pour détecter des interactions possibles de la NC avec les membranes. Nous avons montré que NC se lie avec une forte affinité par voie électrostatique aux membranes contenant des lipides anioniques, permettant de localiser NC au niveau des têtes lipidiques. NC déstabilise la membrane de manière dose-dépendante. Les complexes NC-ADN se lient également aux membranes comme la NC libre, permettant de suggérer une participation de NC à l'import nucléaire du complexe de pré-intégration.