Functional regulation of class II HDAC trough their catalytic inhibition
Institution:
Strasbourg 1Disciplines:
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Abstract EN:
Human HDACs comprise a family of 18 different members which are grouped into four classes. Class I (HDAC 1-3,8), class II (HDAC4-7,9,10 of which HDAC4, 5, 7 and 9 form a class II a subgroup due to a common structural organization, while HDAC6 is member of class IIb), class III, also referred to as sirtuins (SIRT1-7) and class IV (HDAC11). Classes I, II and IV HDACs share common features, as all their members are zinc-dependent and exhibit some sequence similarities, while class III HDACs are NAD+-dependent enzymes without homology the other HDACs(1). Pan-inhibitors like SAHA, which is currently in phase III clinical trials and has recently been approved for treatment of cutaneous T cell lymphoma, inhibit both classes I and II enzymes, while MS275 is a subclass I selective inhibitor, which blocks the activities of HDAC 1, 2 and much less efficiently HDAC 3. Also class II selective inhibitors have been generated, marking the onset of a dissection of the various activities of HDACs. Notably, while induction of TRAIL appears to be associated with inhibition of class I enzymes in cancerous systems, other cellular functions involve the action of class II HDACs, like the regulation of the differentiation, mainly the cardiac differentiation. In differentiation systems: C2C12 cells, F9 cells, 3T3L1 cells. We tested a new compound HDAC inhibitor, specific for HDAC class 2 in one leukemic model, U937 cells, and various differentiation systems, such as the C2C12 cells for muscle differentiation, the F9 cells for endodermal differentiation and 3t3l1 cells for adypocyte differentiation. Interestingly we found that in C2C12 cells the HDAC class 2 inhibitor blocked the catalytic action of the HDAC class 2, but stabilized the interaction between the transcriptional factor MEF2D and HDAC4. MEF2D is the main transcriptional factor, responsible for the terminal muscle differentiation, and its transcriptional activity inhibition consequently blocked the muscle differentiation. In a similar way in both the other two systems we evaluated the differentiation inhibition and we found that transcriptional activity of RAR and PPARγ, respectively essential for the differentiation of the two systems, was blocked either in vitro in the first case either in vivo in the second case. In the case of the PPARγ induced differentiation, the experiments were assayed in the 3T3L1 cells. The treatment of these cells with Troglitazone induced adypocyte differentiation, while the presence of the MC1568 blocked it completely. Analyzing the Pparg’s expression level for RT-PCR, we found that its level was highly decreased after treatment with the MC1568. Interestingly the treatment of a mouse stably expressing a PPRE-luc, PPAR responsive elements luciferase reporter, blocked the transcriptional activity of PPARγ, showing in this case that the compound was regulating both the nuclear receptor’s transcriptional activity and the transactivation. In tumour model: MCF7 cells In cancer systems, such as MCF7 cells we found that the HDAC class 2 inhibitor MC1568 was inducing HDAC4 sumoylation, that, as previously showed (2) increases the HDAC4 catalytic action. The transfection of a specific HDAC4 sumoylation mutant in F9 cells decreased the repressory power on a note RAR target gene, Collagen IV. We were able to demonstrate that the treatment with MC1568 was regulating the activity of two transcriptional factor, RAR alpha and NF-KB, on three target genes, IRF1, TNF and TRAIL. The HDAC4 sumoylation mediated by RANBP2 repressed transiently the expression of these target genes, that were up-regulated after the complete degradation of HDAC4. Acute promyelocitic leukemia (APL), NB4 cells The NB4 cells is a cellular system of acute promyelocitic leukemia (APL). This disease is characterized by the presence of a fusion protein, PMLRAR alpha, with a strong repressory activity, mediated by the enhanced recruitment of corepressory complexes. The patients are treated with the differentiation therapy with retinoic acid (ATRA). Even if it is quite efficient to treat it, it still remains the problem of resistances, recidives and toxicity, done by the longer treatments, that give the, as said, ATRA syndrome and teratogenicity. In these cells we found that the combination among ATRA and MC1568 seems synergic, inducing a caspase independent cell death, even if in presence of caspases activation. The ZVAD inhibitor (pan-inhibitor for all caspases) failed to block the death induced by the MC1568 and by the combination among the two compounds. Analyzing the activation of the caspases it seemed that the pathway activated was mainly mediated by caspase 8. At the same time we found a strong release of cytochrome C, demonstrating the involvement of the mitochondria in the death induced by these two compounds. The use of a specific inhibitor, the NAC inhibitor, was able to reduce the death mediated by ATRA and MC1568, showing that the pathway was mainly regulated by the NAC dependent way. At this time, we are arrived to select the pathway regulated by this compound. Knowing that an HDAC inhibitor like MS275, specific inhibitor for class 1 HDACs, induce in the same system a caspase-dependent cell death, mainly regulated by TRAIL3, our observation would suggest that the class 2 HDAC inhibition is specifically regulating a pathway that is mainly caspase-independent. This observation could be usefull for treatment therapy, not only ammeliorating the treatment with retinoids, but overcoming possible resistances mediated by mutations and alteration in receptor expression in tumoral cells. Conclusions In my work I have evaluated the effect of a class 2 HDAC inhibitor in several systems, differentiative and cancerous, highlighting its effects in transcriptional regulation and cell death.
Abstract FR:
Les HDACs humains consistent en une famille de 18 membres différents groupés dans quatre classes. Classe I (HDAC 1-3. 8), classe II (HDAC4-7, 9,10 dont HDAC4, 5, 7 et 9 forment un sous-groupe dû à une organisation structurale commune, alors que HDAC6 est membre de classe IIb), classe III, également désignée sous le nom des sirtuines (SIRT1-7) et classe IV (HDAC11). Les classes I, II et IV partagent des caractéristiques communes, car tous leurs membres sont zinc-dépendants et montrent quelques similitudes de séquence, alors que dans la classe III HDACs il s’agit d’enzymes NAD+-dépendant sans homologie aux autres HDACs. Les pan-inhibiteurs tels que SAHA, qui est actuellement dans des essais cliniques en phase III et a été récemment approuvé pour le traitement du lymphome à cellule T cutané, bloquent les enzymes de classes I et II, alors que le MS275 est un inhibiteur sélectif de la sous-classe I et bloque les activités de HDAC 1, 2 et beaucoup moins efficacement HDAC 3. Des inhibiteurs sélectifs de la classe II ont été également produits, permettant ainsi la dissection des diverses activités de HDACs. Notamment, alors que l'induction de TRAIL semble être associée à l'inhibition des enzymes de la classe I dans les systèmes cancéreux, d'autres fonctions cellulaires dépendent de l'action des HDCAs classe II, comme la régulation de la différentiation, principalement la différentiation cardiaque. HDACis dans des systèmes de différentiation : C2C12 cellules, F9 cellules, cellules 3T3L1. Nous avons examiné MC1568, un nouvel inhibiteur des HDACs, spécifique pour la classe II, dans un modèle leucémique, les cellules U937, et divers systèmes de différentiation, tels que les cellules C2C12 pour la différentiation de muscle, les cellules F9 pour la différentiation endodermale et les cellules 3t3L1 pour la différentiation des adypocytes. De façon intéressante, nous avons constaté que dans les cellules C2C12 l'inhibiteur des HDAC classe 2 bloque l'action catalytique de la classe 2 de HDAC, mais stabilise l'interraction entre le facteur transcriptionnel MEF2D et HDAC4. MEF2D est le principal facteur transcriptionnel, responsable de la différentiation terminale de muscle, et par conséquent l’inhibition de son activité transcriptionnel bloque la différentiation du muscle. D'une manière semblable, dans les deux autres systèmes nous avons évalué l'inhibition de la différentiation et nous avons trouvé que l’activité transcriptionnelle de RAR et PPARγ, essentiels pour la différentiation des deux systèmes respectivement, a été bloqué in vitro dans le premier cas et in vivo dans le deuxième cas. Dans le cas de la différentiation induite par PPARγ, on a utilisé le système des cellules 3T3L1. Le traitement de ces cellules avec Troglitazone induit la différentiation d'adypocytes, alors que la présence du MC1568 le bloque complètement. En analysant le niveau de l'expression de PPARγ pour RT-PCR, nous avons constaté que son niveau a été fortement diminué après traitement avec MC1568. De façon intéressante, le traitement d'une souris exprimant stablement le gène de la luciferase sous le contrôle de l’élément de réponse de PPAR (PPRE-Luc), a bloqué l'activité transcriptionnelle de PPARγ, prouvant que le composé régule l'activité transcriptionnelle de récepteur nucléaire et sa transactivation. Inhibition des HDACs classe II dans des modèles de cancer - Cellules MCF7 Dans des systèmes de cancer, tels que les cellules MCF7 nous avons constaté que l'inhibiteur des HDACs classe 2, MC1568, induisait la sumoylation de HDAC4 ce qui augmente l’activité catalytique de HDAC4 comme cela a été précédemment démontré. La transfection d'un mutant spécifique empêchant la sumoylation de HDAC4 en cellules F9 a diminué la capacité de répression de RAR sur un de ces gènes cibles, le collagène IV. Nous avons démontré que le traitement avec MC1568 régule l'activité transcriptionelle des deux facteurs de transcription, RAR alpha et NF-KB, sur trois gènes cibles, IRF1, TNF et TRAIL. La sumoylation de HDAC4 par RANBP2 réprime transitoirement l'expression de ces gènes cibles. Cette répression est perdue lorsque HDAC4 est dégradé. Leucémie promyelocitaire aigüe (APL), cellules NB4 Les cellules NB4 sont un système cellulaire de leucémie promyelocitaire aigüe (APL). Cette maladie est caractérisée par la présence d'une protéine de fusion, PMLRAR alpha, avec une forte activité de répression due au recrutement augmenté des complexes corépresseurs. Les patients sont soignés avec la thérapie de différentiation par de l'acide rétinoïque (ATRA). Même si le traitement est efficace, il reste toujours les problèmes de résistance et toxicité, causés par les traitements plus longs, qui sont à l’origine du syndrome d'ATRA et des effets tératogènes. Dans les cellules NBA, nous avons constaté que la combinaison d’ATRA et MC1568 agit de manière synergique, induisant une mort indépendante de caspases. L'inhibiteur ZVAD (un pan-inhibiteur pour toutes les caspases) ne bloque pas la mort induite par le MC1568 seul ni par la combinaison des deux composés. La voie des caspases activée a été principalement celle de la caspase 8. En même temps, nous avons trouvé une importante libération du cytochrome C, démontrant la participation de la voie de mort intrinsèque dans la mort induite par ces deux composés. L'utilisation d'un inhibiteur spécifique, le NAC, réduit la mort induite par ATRA et MC1568, prouvant que la voie engagée est celle du NAC. Sachant qu'un inhibiteur de HDAC classe I comme le MS275 induit dans le même système une mort cellulaire caspase-dépendante, principalement via TRAIL, notre observation suggérerait que l'inhibition des HDAC classe 2 active une voie qui est principalement caspase-indépendante. Conclusions Dans mon travail de thèse j'ai évalué l'effet d'un inhibiteur sélectif des HDAC classe II dans plusieurs systèmes et j’ai défini ses effets sur la différenciation et l’apoptose. Cette analyse sera utile pour générer des nouveaux inhibiteurs sélectifs pour les HDACs pour le traitement contre le cancer avec un indice thérapeutique plus élevé que les pan-inhibiteurs des HDACs actuels.