Etude du mécanisme d'interaction du domaine de liaison à l'ADN de la poly(ADP-ribose)polymerase (PARP-1) avec des cibles nucléiques
Institution:
Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Activation of Poly(ADP-ribose)polymerase (hPARP-1) is an immediate response to DNA damage. For the research of antitumor agents in addition of actual chemotherapies and radiotherapies, the protein PARP-1 is a good target since it is implicated in facilitating DNA repair. Due to the highly conserved catalytic domain into the whole PARPs family, the elucidation of the molecular binding mechanism appears essential not only for a better knowledge of its biological function but also for developing specific inhibitors. In this context, we have analyzed the binding mechanism of PARP-1 in the presence of nucleic acid targets in order to better understand the protein's function. After the characterization of the fluorescence properties of the PARP-1 DBD, we have determined, the binding parameters of the PARP-1 DBD. This study showed that the recognition of a DNA junction between a double strand and a single strand bearing a 5' recessed end by DBD is highly specific. Trp residues seem to be directly implicated in the nucleic acids binding by stacking interactions. We also modelized the binding and demonstrated a protein PARP-1 dimerization. The asymmetric protection of DBD to DNA seems to be correlated with the formation of a catalytic dimer. Poly(ADP-ribose)activity measurements associated with fluorescence spectroscopy revealed that the activity levels of PARP-1 is strongly correlated with the binding stochioemetry. Even, a tightly relation was established between the binding stochiometry and the nucleic acids structures. Indeed, a great activity is measured when a DBD dimer is formed. Finally, by generating a mutant of DBD PARP-1 in position Trp51 in the zinc finger FI, we have detailed the implication of this Trp residue in the DBD structures maintain. By this work, the Trp51 seems to be relevant for keeping the binding properties of the DBD PARP-1.
Abstract FR:
L'activation de la poly(ADP-ribose)polymerase (hPARP-1) intervient en réponse aux cassures dans l'ADN. Dans le cadre de la recherche de traitements anti-cancéreux, la protéine PARP-1 constitue une cible de choix de par son implication dans les mécanismes de réparation de l'ADN. Etant donné la conservation du site catalytique au sein de la superfamille PARPs, l'élucidation au niveau moléculaire du processus de liaison à l'ADN de PARP-1 apparaît essentielle pour la compréhension de son rôle biologique et pour le développement d'inhibiteurs spécifiques dirigés contre la fonction de liaison. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés au mécanisme de liaison entre le domaine de liaison (DBD) de la hPARP-1 et des cibles nucléiques. Après avoir caractérisé les propriétés de fluorescence du DBD de PARP-1 nous avons déterminé les paramètres de liaison du DBD. Cette étude a mis en évidence une spécificité de reconnaissance au niveau de la jonction entre un double et un simple brin d'ADN avec une extrémité 5' rentrante. Le rôle des résidus tryptophanes apparaît essentiel dans la reconnaissance de la structure nucléique via des interactions de type empilement. Ces résultats nous ont permis de modéliser la liaison et de démontrer une dimérisation de la PARP-1 sur l'extrémité 5' rentrante. La position asymétrique de la PARP-1 sur l'ADN observée par empreinte à la DNase I semble corrélée avec la formation d'un dimère catalytique. Les mesures de l'activité de poly(ADP-ribosyl)ation combinées aux études par spectroscopie de fluorescence nous ont permis de corréler la stoechiométrie de liaison avec le niveau d'activité. Ainsi, une forte activité est mesurée lors de la formation d'un dimère protéique sur la cible nucléique. Enfin, la génération par mutagenèse dirigée d'un mutant du résidu Trp 51 du doigt à zinc FI, a permis de préciser le rôle de ce résidu dans le maintien conformationnel du DBD et son importance dans la conservation des propriétés de liaison du DBD.