Etude de l'interaction entre la toxine binaire de Bacillus sphaericus et son récepteur chez le moustique Culex pipiens
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Some bacteria from the genus Bacillus are widely used as bio-insecticide because they produce entomopathogenic toxins. The bacillus sphaericus binary toxin (Bin) displays a high larvicidal activity against Culex pipiens mosquitoes which are vectors of pathogens responsible for tropical diseases such as filariases or West Nile fever. The specificity of Bin is linked to the presence of a receptor named Cpm1 located on the brush border midgut epithelial cells of Culex mosquito larvae. The study of the Bin cellular mode of action is motivated by the development of resistance phenomenon to this toxin in order to determine what step is implicated in a particular resistance mechanism. I analyzed the expression of Cpm1 after its transfection in the insect Sf9 and the mammalian MDCK cell lines. I have demonstrated that Cpm1 is a a-glucosidase anchored to the plasma membrane of both cell lines by a GPI. Its affinity for Bin is similar to that observed on Culex midgut epithelial cells. Electrophysiology experiments done on Cpm1 expressing MDCK cells showed that Bin induces a change in the plasma membrane permeability to ions. The DNA sequence analysis of cpm1 alleles present in two Bin resistant strains revealed the presence of mutations responsible of the alteration of the toxin/receptor interaction. In the BP strain, the apparition of a stop mutation at the 2/3 of the sequence led to the loss of Cpm1. In the GEO strain, the C-terminal hydrophobic sequence is shortened by the apparition of a stop mutation. This truncated form of Cpm1 is no longer anchored to the plasma membrane but is released in the extra-cellular medium indicated the loss of the GPI anchorage.
Abstract FR:
Certaines bactéries du genre Bacillus sont utilisées comme bio-insecticides car elles produisent des toxines entomopathogènes. La toxine binaire (Bin) de Bacillus sphaericus possède une forte activité larvicide sur le moustique Culex pipiens vecteur d'agents infectieux responsables de maladies comme les filarioses ou la fièvre " West Nile ". La spécificité de Bin dépend de la présence d'un récepteur, nommé Cpm1, au niveau de la bordure en brosse des cellules épithéliales de l'intestin moyen des larves de Culex. Le développement de phénomènes de résistance à Bin justifie la nécessité de connaître le mode d'action de cette toxine afin de pouvoir déterminer la ou les étapes à laquelle se rapporte un mécanisme de résistance donné. Je me suis attaché à analyser l'expression de Cpm1 par transfection stable dans les lignées cellulaires d'insecte Sf9 et de mammifère MDCK. J'ai montré que Cpm1 est une a-glucosidase ancrée à la membrane plasmique de ces deux types cellulaires par GPI. Son affinité pour Bin est similaire à celle observée sur les cellules épithéliales des larves de moustiques sensibles. Une modification de la perméabilité de la membrane plasmique aux ions induite par Bin a été mise en évidence par des expériences d'électrophysiologie sur les cellules MDCK exprimant Cpm1. L'analyse de la séquence de l'allèle de cpm1 présent chez 2 souches résistantes à Bin a révélé la présence de mutations responsables de l'altération de l'interaction toxine/récepteur. Chez la souche BP, l'apparition d'une mutation stop aux 2/3 de la séquence entraîne la perte de la protéine Cpm1. Chez la souche GEO, il y a raccourcissement de l'extrémité C-terminale de Cpm1 d'une douzaine d'acides aminés. Cette forme tronquée n'est plus ancrée à la membrane plasmique mais est sécrétée dans le milieu extra-cellulaire, indiquant la perte de l'ancrage GPI.