Etude d'une nouvelle classe d'inhibiteurs de la rétrotranscriptase et de l'intégrase du virus de l'immunodéficience humaine de type (VIH-1)
Institution:
Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
In order to develop new HIV-1 reverse transcriptase (RT) inhibitors, we studied the 3,7-dihydroxytropolones (3,7-DHT) which are known to inhibit the human inositol monophosphatase by chelating the 2 catalytic Mg2+ ions separated from 3,7Å. The HIV-1 polymerase and RNase H catalytic sites contain two Mg2+ ions, distant from de 3,57 and 4Å, respectively. Moreover, the HIV-1 integrase (IN) possesses a catalytic platform similar to the RNase H active site. Therefore, we decided to study the 3,7-DHT on the HIV-1 RT and IN activities. We observed a specific inhibition by some 3,7-DHT derivatives for each RT activity. We showed that the inhibition of the polymerase activity is non-competitive in regard to the dNTP, like non-nucleoside RT inhibitors (NNRTIs). Nevertheless, 3,7-DHT bind neither in the NNRTIs site, nor to the nucleic acids that are substrates of RT activities. Furthermore, 3,7-DHT are not able to induce the dissociation of the heterodimeric form of the active RT. Finally, we showed that 3,7-DHT do not inhibit the polymerization at the translocation step. The implication of the catalytic cations into the mechanisms of RT and IN inhibition by 3,7-DHT has also been studied. In order to increase the 3,7-DHT efficacy and affinity, and to decrease their cytotoxicity, we wanted to get the cristallographic struture of the RT/(primer/template)/dNTP ternary complex with a 3,7-DHT. Cristals from different complex have been obtained, but need to be improved. Taken together these results allow the development of a rationalized design of RT and IN inhibitors, in order to get more specific and efficient compounds of one or another activity.
Abstract FR:
"L'Organisation Mondiale de la Santé estime que le VIH-1 est porté par 40 millions de personnes à travers le monde, et qu'il a causé 3,1 millions de décès et 4,9 millions de nouvelles infections au cours de l'année 2004. Les traitements actuels ciblent principalement la rétrotranscriptase du VIH-1 (RT), qui catalyse le passage de l'ARN viral génomique en ADN double brin, substrat de l'intégrase virale (IN). Les antiviraux dirigés contre la RT et utilisés en thérapie sont soit des terminateurs de chaîne analogues de nucléosides (NRTIs), soit des inhibiteurs non-nucléosidiques (NNRTIs) qui se fixent au niveau d'une poche hydrophobe, à proximité du site de fixation des nucléotides. Dans le cadre du développement de nouveaux inhibiteurs de la RT, nous nous sommes intéressés aux 3,7-dihydroxytropolones (3,7-DHT), qui inhibent l'inositol monophosphatase humaine par chélation de deux ions Mg2+ catalytiques distants de 3,7Å. Or les sites catalytiques polymérase et RNase H de la RT contiennent respectivement deux ions Mg2+ distants de 3,57 et 4Å. En outre, l'IN du VIH-1 possède une plate-forme catalytique proche de celle du site RNase H. Nous avons ainsi entrepris d'étudier l'effet des 3,7-DHT sur les activités de la RT et de l'IN du VIH-1. Nous avons observé une inhibition spécifique de l'une ou l'autre activité de la RT par certaines 3,7-DHT. Des études enzymatiques ont ensuite montré que l'inhibition de l'activité ADN polymérase est non-compétitive vis-à-vis des nucléotides, à l'instar des NNRTIs. Néanmoins, l'étude de RT résistante ou dépourvue du site de fixation des NNRTIs permet d'exclure un mode d'action identique à cette classe d'inhibiteurs. Des expériences de gel-filtration, permettant de suivre l'état d'oligomérisation de la forme active de la RT, hétérodimérique, montrent que les 3,7-DHT ne sont pas capables de la dissocier. L'inhibition des activités de la RT par liaison des 3,7-DHT aux acides nucléiques a été écartée, entre autres, par des expériences de fluorescence. Enfin nous avons montré que les 3,7-DHT n'inhibent pas la polymérisation lors de l'étape de translocation. En revanche, une forte baisse de l'inhibition de la synthèse d'ADN a été mise en évidence lorsque la concentration en Mg2+ diminue, ce qui suggère que les 3,7-DHT ne lient le site actif polymérase qu'en présence des ions Mg2+. L'implication des cations catalytiques dans les mécanismes d'inhibition par les 3,7-DHT a également été étayée par l'observation d'une inhibition des activités de " processing " et de transfert de l'IN, dépendante du cation utilisé. Malheureusement, des cultures cellulaires en présence de 3,7-DHT ont révélé une cytotoxicité importante. Ce résultat était partiellement prévisible, compte tenu de l'existence de nombreuses enzymes bimétalliques cellulaires et de l'utilisation de 3,7-DHT de première génération. Dans l'objectif d'améliorer ces composés, sur la base de leur relation structure/activité, nous avions également pour projet d'obtenir la structure cristallographique d'un complexe ternaire RT/(matrice/amorce)/dNTP, en présence d'une 3,7-DHT. Des cristaux de différents complexes ont été obtenus, mais n'ont pas permis d'obtenir de clichés de diffraction aux rayons X et restent par conséquent à améliorer. Nous avons également étudié l'influence de la concentration en Mg2+ libre sur les activités catalytiques de la RT du VIH-1. En résumé, les résultats obtenus au cours de mon travail de thèse permettent d'élaborer les prémices d'une stratégie de conception " rationalisée " d'inhibiteurs de la RT et de l'IN, dans l'objectif d'obtenir des composés plus spécifiques et plus affins de l'un ou l'autre site catalytique. "