thesis

Inhibition de la transcription TAT-dépendante du VIH-1 par CTIP2 : un nouveau membre identifié du complexe PTEF-b inactif

Defense date:

Jan. 1, 2009

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Institution:

Strasbourg

Disciplines:

Molecular and cellular biology

Authors:

Directors:

Abstract EN:

In 2007, 33. 2 million people worldwide are infected by Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1). Despite huge therapeutics advances since the virus discovery in 1983, AIDS, the disease caused by HIV-1, is still an incurable sickness. In fact, the virus can never be cleaned from the body. Several studies have shown that it can establish cellular reservoirs. Theses latent viruses are drug insensitive and constitute HIV resurging points. Cleaning these reservoirs seems to be a fundamental step toward patients curing. Since many years, our laboratory studies the molecular mechanisms involved in HIV latency establishment. A study has shown that the transcription factor CTIP2 (COUP-TF interacting protein 2) is able to recruits at viral promoter HDAC-1, -2 and SUV39H1 enzymes. These enzymes then acetylate and methylate histones promoting formation of a repressive heterochromatic environment. Another paper from our lab suggests an interaction between the viral protein Tat and CTIP2. During my thesis, I’ve tried to determine the impact of CTIP2 on Tat activity, in order to decipher whether CTIP2 can also impact viral reactivation. We have shown by luciferase assays that CTIP2 can repress Tat-dependant transcription of HIV promoter. MRNA Q-PCR quantification suggests that initiation and elongation are impacted. In order to decipher how CTIP2 can modulate Tat activity, we have tried to evaluate its impact on an essential Tat partner: the PTEF-b complex formed by the proteins CyclinT1 and CDK9. We have shown that CTIP2 is also able to repress PTEF-b transcriptional activity. Immunoprecipitation experiments suggest that CTIP2 is an inactive PTEF-b complex partner. In fact, it can bind CyclinT1, CDK9, Hexim1 and the 7SKsnRNA, but not BrD4. Moreover, kinase assays suggest that CTIP2 is a PTEF-b activity repressor. By Western Blot experiments and RNA quantification in immunoprecipitated complexes, we suggest that Tat is able to recruit CTIP2 from the inactive PTEF-b complex and to promote CTIP2-TAR binding. We have also noticed that CTIP2 facilitates HDAC-1, -2 and SUV39H1 recruitment at the HIV promoter via Tat. So, we here suggest that CTIP2 is physiologically present in two different complexes: - in the inactive PTEF-b complex - in a chromatin modifying complex where CTIP2 interacts with HDAC-1, -2 and SUV39H1. 1 When the cell becomes infected by HIV-1, Tat is able to recruit a part of CTIP2 present in inactive PTEF-b complex. These Hexim1 and 7SKsnRNA-free CTIP2 proteins can then bind chromatin modifying enzymes. Tat may induce recruitment of these enzymes at HIV promoter via CTIP2, leading perhaps to the formation of a transcriptional repressive environment. CTIP2 gets a double repressive impact on HIV-1 transcription: during the early phase when Tat is not yet produced and also during the late phase when Tat is present. These results highlight the significance that CTIP2 have in latency establishment and maintenance and make CTIP2 a potent target for new therapeutics approaches.

Abstract FR:

Le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) infecte, en 2007, 33,2 millions d'individus à travers le monde (ONUSIDA 2007). Malgré d'importantes avancées thérapeutiques depuis sa découverte en 1983, la pathologie induite par le VIH-1, le syndrôme d'immunodéficience acquise (SIDA), demeure une maladie incurable. En effet, le virus ne peut être totalement éliminé de l'organisme. De nombreuses études ont démontré qu'il était capable d'établir des réservoirs dans certaines cellules du système immunitaire. Les virus restant latents dans les réservoirs sont insensibles aux thérapeutiques actuelles et constituent les points de résurgeances du VIH-1. Devant les échecs récurrents de la thérapie vaccinale prophylactique et thérapeutique, il apparaît de plus en plus que la purge de ces réservoirs constituerait une étape fondamentale vers la guérison des malades. Depuis plusieurs années, notre laboratoire étudie les mécanismes de mise en place de la latence du VIH- 1. Une étude a démontré que le facteur de transcription CTIP2 (COUP-TF interacting protein 2) est capable de recruter sur le promoteur viral les enzymes HDAC-1 et 2 ainsi que SUV39H1. 1 via la protéine Sp1. Ces enzymes sont alors capables de déacétyler et de méthyler les histones présents dans le génome intégré du virus, créant ainsi un environement hétérochromatinien transcriptionnellement inactif. Une précédente publication de l'équipe a également mis en évidence une interaction entre CTIP2 et la protéine virale TAT. Durant ma thèse j'ai donc étudié l'impact de CTIP2 sur l'activité de la protéine virale TAT, afin de déterminer si CTIP2, en plus d'induire la latence lors de la phase précoce, était capable également d'induire la latence virale en contrecarant l'activité de TAT lors de la phase tardive. Tout d'abord, par des essais luciférase dans des cellules microgliales, nous avons démontré que CTIP2 réprimait la transcription TAT-dépendente du promoteur du VIH-1. La quantification des ARNm par Q-PCR indique que les phases d'initiation et d'élongation sont réprimées. Afin de déterminer comment CTIP2 exerce son action répressive sur TAT, nous avons cherché à évaluer son impact sur un partenaire essentiel de la proteine viral : le complexe PTEF-b. En effet, l'activité de TAT dépend des deux proteines formant le complexe PTEF-b : CyclinT1 et CDK9. Il est hautement régulé et existe sous deux formes : un complexe actif où CyclinT1et CDK9 sont libre ou liés à la protéine BrD4, et un complexe inactif où CyclinT1 et CDK9 sont liés à la protéine HEXIM1 et au petit ARN nucléaire 7SK. Nous avons démontré, par des essais transcriptionnel, que CTIP2 était capable de réprimer l'activité du complexe PTEF-b dans une lignée de cellules microgliales, ainsi que de potentialiser l'effet du flavopyridol, un inhibiteur de la CDK9. Les expériences d'immunoprécipitations ont démontré que CTIP2 est un membre du complexe PTEF-b inactif. En effet, elle est capable de se lier aux protéines CyclinT1, CDK9, HEXIM1 et à l'ARN 7SK mais pas à la protéine BrD4. La liaison entre CTIP2 et le couple CDK9-CyclinT1 est indirect et dépendente de l'ARN 7SK comme nous l'indique nos expériences de co-immunoprécipitation aprés digestion à la RNAse. De plus des essais kinase in vitro montrent que l'activité du complexe PTEF-b est fortement diminuée dans des cellules surexprimant CTIP2. Afin d'apréhender l'évolution dynamique des différents complexes, nous avons procédé à des expériences de détection de protéines par Western Blot et la quantification d'ARN dans des immunoprécipitations. Ces tests nous ont permis d'arriver à la conclusion que TAT est capable de recruter CTIP2 dans le complexe PTEF-b inactif afin de créer un complexe TAT-CTIP2-TAR. Nous avons également constaté que l'action repressive de l'activité de TAT par CTIP2 n'est dû ni à un blocage du recrutement de PTEF-b par TAT, ni à une diminution de l'activité de complexe PTEF-b lié à TAT. En revanche, lorsque TAT recrute CTIP2, celui-ci induit le recrutement via CTIP2 des enzymes HDAC-2 et SUV39H1. 1 capables d'établir un environement hétérochromatinien. En conclusion nous suggérons que la protéine CTIP2 était présente physiologiquement dans deux complexes différents : · le complexe PTEF-b inactif dont il est un nouveau membre identifié · un complexe responsable du remodellage de la chromatine où CTIP2 est en association des HDAC de classe I ainsi que SUV39H1. 1. Lorsque la cellule est infectée par le VIH-1, la protéine TAT est capable de recruter une partie des protéines CTIP2 présentes dans les complexes PTEF-b inactifs. CTIP2, alors débarassé d'HEXIM1 et du 7SK, pourrait alors lier les enzymes du complexe de remodellage de la chromatine. TAT induirait donc le recrutement de ces enzymes via CTIP2 au niveau de promoteur, conduisant ainsi peut-être à la création d'un environement hétérochromatinien. CTIP2 possède donc une double action de répression de la transcription du VIH-1, lors de la phase précose en l'absence de TAT mais aussi lors de la phase tardive en présence de TAT. Ceci démontre l'importance de ce facteur dans l'établissement et le maintien de la latence viral et en fait une cible potentielle pour de futures approches thérapeutiques.