Étude de la régulation transcriptionnelle du gène Tcirg1 dans le cadre de la différenciation ostéoclastique
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Bone undergoes constant remodeling, and its homeostasis is under the control of two major cell types, namely osteoblasts and osteoclasts. The Tcirg1 gene encodes the osteoclast-specific a3 isoform of the V-ATPase a subunit. The V-ATPase complex is a proton pump responsible for the bone matrix degradation and mutations in the a3 subunit account for an osteopetrotic phenotype both in human and in mouse. Using the RAW264. 7 cell line as an osteoclast differentiation model, we studied the regulation of Tcirg1 gene expression. We identified PARP-1 as a transcriptional repressor which is downregulated during RANKL-induced osteoclastogenesis. We identified the AP-1 dimer JunD/Fra2 as an activating transcriptional factor involved in Tcirg1 promoter activity upregulation. We also identified a second PARP-1 interacting sequence adjacent to the JunD/Fra2 binding site. Finally, the data we obtained using Tcirg1 gene promoter deleted for the JunD/Fra2 site favoured the hypothesis of the existence, in pre-osteoclastic cells, of an inhibitory complex involving PARP-1 and the JunD/Fra2 binding sites we identified. We also studied the expression of TIRC7, an alternative product of the Tcirg1 gene which was identified in activated T-cells. Using the El-4 lymphocytic cell line as a model, we observed that the activation signal induced the splicing of the intron 5 of pre-mRNA species stored in the nucleus and their translocation to the cytoplasm. Lastly, we provided data suggesting the existence of a translational regulation responsible for a3 or TIRC7 synthesis, depending on the cell type. In the last section, we adressed the issue of PARP-1 involvement in the regulation of Tracp gene, a gene which encodes an acid phosphatase strongly up-regulated during osteoclastogenesis. As previously observed for Tcirg1 gene, we identified PARP-1 as a transcriptional repressor of Tracp expression, therfore establishing a new role for PARP-1 in RANKL-induced up-regulation of two critical genes for the osteoclast biology. Altogether, the results obtained in this study led us to propose the first model, involving PARP-1 inhibition release and JunD/Fra-2 binding, for Tcirg1 gene upregulation during osteoclastogenesis. Moreover, we provided data suggesting a new role for PARP-1 as a transcriptional factor critical for the osteoclast biology.
Abstract FR:
Le tissu osseux est renouvelé en permanence et son homéostasie est sous le contrôle des activités antagonistes de deux types cellulaires, les ostéoblastes et les ostéoclastes. Le gène Tcirg1 code pour l’isoforme 3 de la sous-unité « a » de la V-ATPase exprimée dans l’ostéoclaste. Dans ce type cellulaire, la V-ATPase est une pompe à protons principalement impliquée dans la dégradation de la matrice osseuse, et des mutations sur la protéine a3 sont responsables de phénotypes ostéopétrotiques chez l’homme et la souris. En utilisant la lignée RAW264. 7 comme modèle de différenciation ostéoclastique, nous avons étudié la régulation de l’expression du gène Tcirg1. Nous avons identifié un répresseur transcriptionnel, PARP-1, dont l’activité est diminuée au cours de la différenciation par le RANKL. (Beranger et al. , 2006) Nous avons ensuite mis en évidence que le dimère AP-1 JunD/Fra2 était un facteur activateur responsable de l’induction de l’activité du promoteur Tcirg1. Nous avons identifié une seconde séquence capable d’interagir avec PARP-1 située directement en aval du site AP-1. En conclusion, les données obtenues en utilisant une construction promotrice délétée du site AP-1 favorisent l’hypothèse de l’existence, dans les pré-ostéoclastes, d’un complexe inhibiteur impliquant PARP-1 et le site JunD/Fa2 identifié. Nous avons également étudié l’expression de TIRC7, un produit alternatif du gène Tcirg1 qui a été identifié dans les cellules T activées. En utilisant la lignée lymphocytaire El-4 comme modèle cellulaire, nous avons observé que le signal d’activation induisait l’épissage de l’intron 5 d’un stock de pré-ARNm localisés dans le noyau, suivi de leur translocation vers le cytoplasme. Nous avons enfin fourni des données suggérant l’existence d’une régulation traductionnelle responsable de la synthèse des protéines a3 ou TIRC7 en fonction du type cellulaire. Dans une dernière partie du travail, nous nous sommes intéressés à l’implication de PARP-1 dans la régulation du gène Tracp, un gène qui code pour une phosphatase acide induite au cours de l’ostéoclastogénèse. Comme, nous l’avions observé pour Tcirg1, nous avons identifié PARP-1 en tant que répresseur transcriptionnel, établissant ainsi un nouveau rôle pour PARP-1 dans l’induction de deux gènes critiques pour la biologie de l’ostéoclaste. L’ensemble de ce travail nous a conduit à proposer le premier modèle de régulation du gène Tcirg1 au cours de l’ostéoclastogénèse, ce modèle implique l’abolition de l’effet inhibiteur de PARP-1 associé à la fixation de JunD/Fra2. De plus, nous avons fourni des données suggérant un nouveau rôle pour PARP-1 dans la biologie de l’ostéoclaste.