Abstract FR:

Les phénylpropanoi͏̈des (lignines, flavonoi͏̈des, coumarines) sont synthétisés spécifiquement par les plantes et jouent des rôles importants dans le maintient végétal, la pigmentation, les défenses contre les pathogènes et la signalisation. La première étape d'hydroxylation des phénylpropanoi͏̈des est catalysée en position 4 par la cinnamate 4-hydroxylase (C4H). Cet enzyme est un cytochrome P450 déjà décrit dans différentes plantes. Une première partie de ma thèse porte sur un caractérisation du site actif de la C4H et l'identification d'inhibiteurs efficaces et spécifiques de son activité. L'objectif principal est de mieux comprendre la spécificité de substrat de l'enzyme. Dans un premier temps, différents substrats ont été positionnés dans le site actif relativement au fer par une approche RMN. Cette stratégie a nécessite l'ingénierie d'une C4H soluble et plus stable. Dans un second temps, par mutagenèse dirigée, des résidus du site actif critiques pour la fonction de l'enzyme ont été identifiés. Un modèle 3D de la C4H a été construit. L'ensemble des résultats permet de proposer un mode d'interaction du cinnamate dans le site actif du P450. Dans un troisième temps, des inhibiteurs irréversibles de la C4H ont été caractérisés in vitro et in vivo. Ces inhibiteurs sont des outils utiles pour moduler les flux dans la voie des phenylpropanoi͏̈des. Le traitement de cellules de tabac par ces inhibiteurs augmente l'accumulation de salicylate (une molécule de signalisation impliquée dans la défense contre les pathogènes). L'hydroxylation en position 3 des phénylpropanoi͏̈des est une étape plus spécifique de la voie de synthèse des monomères de lignines. Ni l'enzyme, ni son substrat n'étaient caractérisés lorsque ce travail a été initié. J'ai montré que CYP98A3 catalyse efficacement la 3'-hydroxylation des coumaroyls quinate et shikimate, pour former respectivement l'acide chlorogénique et le cafféoyl shikimate. Ces résultats surprenants suggèrent une forte relation entre la synthèse de l'acide chlorogénique et celle des monomères de lignines.