Functional characterization of GCN5 containing complexes
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In higher eukaryotes, RNA Polymerase II transcription is a central cellular process allowing the spatio-temporal expression of a particular set of genes contained in a given genome. Accurately regulated transcription is a prerequisite for many key aspects of the life of an organism. Thus, transcription is tightly controlled by multiple regulatory layers. GCN5 is a member of the Histone Acetyl Transferase (HAT) family that are part of the chromatin modifier complexes. HATs deposit acetyl groups on histone tails that is believed to favour chromatin opening and positively influence transcription initiation. GCN5 is contained in two different muti-subunit macromolecular complexes named ATAC (Ada-Two-A-Containing) and SAGA (Spt-Ada-Gcn5-Acetyl-transferase) that modulate its functional specificity. While the composition and the in vitro activity of these two complexes were intensively studied, little is known about the function of these complexes in vivo. During my thesis, I aimed to better characterise the mode of action of GCN5 containing complexes (GCC) by using recent technology developments. First through the systematic analysis of the in vivo interacting partners of SAGA and ATAC by sensitive mass spectrometry, I identified a stable functional interaction between ATAC and the Mediator, another coactivator complex. I could show that this particular complex is recruited to regulate a set of ncRNA genes. Second, I analysed genome wide binding maps of ATAC produced in different cell types by chromatin immunoprecipitation coupled with high throughput sequencing (ChIP-seq I could show that ATAC binds both active promoter and active enhancer elements. Moreover, I demonstrate that while the ATAC binding at promoters is generally invariant across cell lines, the binding at enhancer is highly variable. This suggests that cell specific programs controlled by ATAC are mainly regulated at the enhancer level.
Abstract FR:
De nombreuses études ont récemment fait émerger le rôle majeur de la régulation des programmes transcriptionnels par des mécanismes épigénétique. Parmi les complexes qui entrainent des modifications post-traductionnelles des extrémités N-terminales des histones, les complexes ayant une activité histone acétyl-transférase (HAT) sont des acteurs majeurs des voies d’activation de la transcription. GCN5 fut la première protéine contenant une activité HAT à être identifiée. Des études détaillées ont permis d’établir la composition de ces deux complexes. De plus, Il a été montré que ces deux complexes contenant GCN5 (CCG) sont capables d’activer la transcription in vitro. Cependant, le rôle in vivo de ces complexes ainsi que son intégration dans les réseaux de régulation transcriptionelle est mal compris. Des anticorps de qualité ont été obtenus pour les différentes sous unités des complexes qui ont permis leur utilisation dans deux approches différentes : (i) Identification de facteurs interagissant avec les CCG. Les CCG (ATAC ou SAGA) ainsi que leurs interactants potentiels ont été purifiés. Nous avons notamment montré que ATAC interagissait dans des contextes cellulaires spécifiques avec un autre co-activateur, transcriptionnel nommé Mediateur. Puis nous avons pu montrer que ce complexe formé des deux entités ATAC-Mediateur avait un rôle important dans la régulation de la transcription certains ARN non codants. (ii) Identification des sites de fixation des CCG a l’échelle du génome. Nous avons utilisé la technique de chromatin immuno-précipitation (ChIP) couplé au séquençage direct à haut débit des fragments purifiés (ChIP-seq) pour identifier le catalogue exhaustif des sites de fixation des CCG. Grace a la comparaison des sites de fixation de ATAC avec la structure de la chromatine, nous avons pu montrer que ATAC avait un double rôle, en participant à l’activation de promoteurs proximaux mais aussi d’éléments de régulation distants (enhancers) des gènes.