Structural and biochemical characterisation of the yeast exosome component Rrp40
Institution:
Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
In eukaryotes, mRNA turnover, RNA quality control and 3'-end processing of several RNAs require the exosome, a multi-subunit protein complex that is conserved from yeast to human, and of which some archaeal counterparts have recently been described. The exosome core consists of six proteins homologous to bacterial RNase PH nucleases and of three S1-domain containing subunits, predicted to be involved in RNA substrate binding. Although the functional characterisation had considerably progressed since exosome first description, no structural information was available for the complex or its subunits, at the onset of this thesis. This thesis presents the first structure of a component of the eukaryotic exosome core, Rrp40 from Saccharomyces cerevisiae. The crystal structure of the N-terminal deletion construct of Rrp40 reveals that an S1 and an unusual KH domain are tightly packed against each other. The interface between the S1 and the KH domain is stabilised by a GxNG sequence, which is uniquely conserved in exosome KH domains. NMR data reveal the presence of a manganese-binding site at the interface of the two domains. Isothermal titration calorimetry shows that yeast Rrp40 and its archaeal counterpart Rrp4 have alone very low affinity for RNA, despite the fact that both S1 and KH domains are known nucleic acid-binding modules. The affinity of an archaeal core exosome for RNA, however, is significantly increased in the presence of Rrp4, indicating that multiple subunits may contribute to cooperative binding of RNA substrates by the exosome.
Abstract FR:
Chez les cellules eucaryotes, la maturation 3’ et la dégradation de nombreux ARNs nécessitent un complexe protéique, l’exosome. La séquence de l’exosome est conservée de la levure à l’homme et récemment des homologues chez les archaeabactéries ont été décrits. Le complexe est composé de six protéines homologues de la RNase PH et de trois protéines qui contiennent domaines S1 et KH. Bien que la caractérisation fonctionnelle de l’exosome ait progressé au cours de ces dernières années, les structures des sous-unités ainsi que l’architecture du complexe restaient à élucider. L'objectif de ce travail de thèse était de résoudre la structure et caractériser les propriétés biochimiques des sous-unités contenant les domaines S1/KH, et plus particulièrement de la protéine Rrp40, une sous-unité spécifique aux cellules eucaryotes. La structure cristalline de Saccharomyces cerevisiae Rrp40 révèle que Rrp40 comprend un domaine S1 ainsi qu'un domaine KH, modules typiques pour l’interaction avec l’ARN. L’interface entre le domaine S1 et le domaine KH est stabilisée par une séquence GxNG conservée dans les domaines KH de l’exosome uniquement. Des données de résonance magnétique nucléaire révèlent la présence d’un site liant le manganèse à l’interface de ces deux domaines. Expériences de titration par calorimétrie montrent que la protéine Rrp40 de la levure et son homologue Rrp4 de S. Solfataricus ont une très faible affinité intrinsèque pour l’ARN. Toutefois, l’affinité du cœur catalytique de l’exosome de S. Solfataricus pour l’ARN est significativement augmentée en présence de Rrp4, suggérant que de multiples sous-unités pourraient contribuer de façon coopérative à la liaison de l’ARN.