Biologie cellulaire et pharmacologie des sécrétases impliquées dans la voie de maturation physiopathologique de la protéine précurseur du peptide ß amyloïde
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Abstract EN:
Alzheimer's disease (AD) is characterized by the cortical and subcortical accumulation of proteinaceous deposits called senile plaques. The main constituent of these aggregates is referred to as amyloid b peptide (Ab). Ab is generated from the b amyloid precursor protein (bAPP) by the subsequent attacks by b- and g-secretases, which liberates the N- and C-terminal moieties respectively by a process called the amyloidogenic pathway. In the non-amyloidogenic pathway, a-secretase cleaves APP within the b-amyloid peptide, thereby preventing deposition of the intact amyloid peptide. Inhibition of b- and g-secretase, or stimulation of a-secretase, is a rational strategy for therapeutic intervention in AD. The work presented in this thesis was aimed to study the cellular biology and the pharmacology of these three secretases. Concerning b-secretase, I contributed to the design of a novel fluorimetric assay which confirmed the identity of BACE1 and BACE2 as b-secretase whereas cathepsin D proved to be a b-secretase " false positive " candidate. Our fluorimetric assay allowed us to identify two generations of new inhibitors. The first generation was a series of peptidomimetic statine-derived compounds. One of them, JMV1195, appeared potent and rather selective in vitro but was unable to block cellular b-secretase activity. Thus, we have designed a new permeable inhibitor, JMV2764 that corresponds to a derivative of JMV1195 to which a penetratin sequence had been added at its N-terminus. JMV2764 was able to affect BACE1 activity in vitro, and to modify Ab production in various cell systems. In a second part of my work, I developed an original cellular approach to study the g-secretase activity. BAPP undergoes two hydrolysis by g-secretase, at the C-terminus of Ab (g-site) and few residues C-terminal to the g-site (e-site). This e-cleavage resembles the S3 Notch cleavage. It appeared of most interest to discriminate the two g-secretase activities on bAPP to study them separately. I developed a cellular model based on the expression of the e-secretase-derived N-terminal fragment of bAPP (APPe) and I showed that APPe was a useful tool to study g-secretase activities and to design specific inhibitors without facing any rate-limiting effect of e-secretase-derived cleavage. Finally, I was interested in the a-secretase identity. Two disintegrin, ADAM10 and ADAM17 were identified as a-secretases. ADAM10 is involved in constitutive and regulated pathway and ADAM17 in the regulated pathway. Initially, I observed that in absence of ADAM10, constitutive secretion strongly decrease without totaly disappearing. I could show that the prohormone convertase 7 (PC7) acted upstream of a-secretase. Moreover, thanks to the development of a fluorimetric assay of a-secretase activity I demonstrated that ADAM9 participate in this pathway due its involvement in the shedding of ADAM10.
Abstract FR:
La maladie d'Alzheimer est un syndrome neurodégénératif se caractérisant par une perte des fonctions cognitives et des troubles de la personnalité. Sur un plan histopathologique, les principales lésions sont les dégénérescences neurofibrillaires et les plaques séniles. Ces dernières sont des agrégats protéiques extracellulaires composés majoritairement de peptide b amyloïde (Ab). Le peptide Ab est produit par l'hydrolyse d'un précurseur membranaire, le précurseur de la protéine b amyloïde (bAPP), par l'action séquentielle de deux activités protéolytiques la b- et la g-sécrétase. C'est la voie amyloïdogénique. La bAPP peut subir une maturation protéolytique alternative par une a-sécrétase dont le site de clivage est situé dans la séquence de l'Ab. C'est la voie non-amyloïdogénique. Ces trois activités protéolytiques peuvent être considérées, à divers titres, comme des cibles thérapeutiques potentielles. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à la Biologie Cellulaire et à la pharmacologie de ces trois sécrétases. En ce qui concerne la b-sécrétase, j'ai contribué à la mise au point d'un nouveau dosage fluorimétrique de l'activité de type b-sécrétase et j'ai pu ainsi confirmer que les enzymes BACE1 et BACE2 se comportaient effectivement comme des b-sécrétases, alors qu'un autre candidat présumé, la cathepsine D ne présentait pas ce type d'activité. Ce dosage fluorimétrique a ensuite permis l'identification de deux générations de nouveaux inhibiteurs. Les inhibiteurs de la première génération sont des dérivés statine de nature peptidique. L'un d'eux, JMV1195, s'est avéré être un excellent inhibiteur de l'activité b-sécrétase in vitro. Toutefois, il s'est avéré être métaboliquement instable, incapable de bloquer l'Ab produit par les cellules et donc peu biodisponibles in vivo. Nous avons donc fait synthétiser un analogue de JMV1195 couplé à un groupement pénétratine, JMV2764, pour circonscrire le problème d'hydrophobicité. JMV2764 garde la capacité de bloquer la b-sécrétase in vitro, mais induit aussi une diminution conséquente de la production du peptide Ab sur des cellules en culture. Cela nous ouvre la voie à une étude chez l'animal ainsi qu'à la synthèse d'autres inhibiteurs couplés à une pénétratine, discriminant les activités BACE1 et BACE2. Dans une deuxième partie de mon travail, je me suis attachée à mettre au point un modèle d'étude original de l'activité g-sécrétase. La bAPP subit deux attaques de type g-sécrétase à l'extrémité C-terminale du peptide Ab (site g) et une dizaine d'acides aminés en aval de la coupure g (site e. Le clivage en e intervient aussi sur d'autres protéines dont Notch-1. Le fait que les g- et e-sécrétases soient une seule et même enzyme est encore discuté. Il était donc important de pouvoir discriminer les deux activités g-sécrétases sur la bAPP afin de pouvoir les étudier séparément. J'ai développé et caractérisé un modèle d'étude fondé sur l'expression transitoire ou stable du produit N-terminal résultant de la coupure e de la bAPP dans divers types cellulaires et j'ai établi que notre construction était substrat de la g-, de l'a et de la b-sécrétase et donc relevante pour l'étude ciblée et spécifique de la g-sécrétase. Enfin, je me suis intéressée à l'identité de l'a-sécrétase. En effet, les disintégrines ADAM10 et ADAM17 ont été identifiées en tant qu'a-sécrétases. Alors qu'ADAM10 est impliquée à la fois dans la voie constitutive et régulée, ADAM17 ne semble impliquée que dans la voie régulée. Dans un premier temps, j'ai pu observé qu'en absence d'ADAM10, la sécrétion constitutive diminue énormément sans toutefois disparaître. Nous savions que la prohormone convertase 7 (PC7) était impliquée dans cette voie mais nous ne savions pas si son rôle était direct ou indirect. J'ai pu démontrer que son implication se faisait en amont de l'activité a-sécrétase. De plus, grâce à la mise au point d'un dosage fluorimétrique de l'activité a-sécrétase j'ai pu montrer qu'un autre candidat potentiel, ADAM9, intervenait aussi dans cette voie mais vraisemblablement dans le contrôle de l'hydrolyse (shedding) d'ADAM10.