On the edge between cell division and differentiation : role of Seh1 in mouse embryonic stem cells
Institution:
Université de Paris (2019-....)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
The nuclear pore complexes (NPCs) are large macromolecular structures embedded in the nuclear envelope, composed of around 30 different proteins called nucleoporins or Nups. Besides their function in regulating nucleo-cytoplasmic transport, several Nups have been reported to play essential roles in other unrelated processes such as chromatin organization, gene regulation, cell cycle control and cell differentiation. The Nup107 complex (also termed Y-complex) is the major structural component of the NPC and is composed of 9 distinct Nups. The Y-complex has been shown to also localize at kinetochores, where it contributes to cell cycle progression. Moreover, one of the components of the Y-complex, Nup133, is required for embryonic stem cell differentiation and proper mouse development. More recent data further indicated a function of Nup133 in the assembly of the nuclear pore basket that may underlie some of its functions. The Y-complex has thus appeared as a key player in multiple biological processes. However, the specific roles of each of its subunits have just started to be investigated. Among the subunits of the Y-complex, Seh1 has been previously reported to play a role in chromosome alignment and segregation in cancer cell lines, by recruiting the Y-complex and several key mitotic regulators (including notably Aurora B) to kinetochores. Interestingly, Seh1 also belongs to the unrelated GATOR2 complex, an essential activator of the mTORC1 kinase, a master regulator of cell growth and proliferation. It is however unknown whether the mitotic functions of Seh1 rely on its localization at the pore, at kinetochores, or the GATOR2-complex. Due to the increasing number of studies implicating nuclear pore components in regulatory processes, Seh1 appears as a good candidate for the coordination of cell cycle and possibly differentiation. My data has revealed that Seh1-/- mESCs are viable in pluripotent state, but that cell survival is severely impaired upon differentiation. Pluripotent Seh1-/- mESCs also feature a cell growth rate delay when in the pluripotent state, correlated with a small (10 min) mitotic delay and and lenghthening of the interphase lenght as compared to WT mESCs. In contrast to previous studies performed in HeLa cells, we observed that both the Y-complex and Aurora B are still properly targeted to kinetochores in these cells. To understand if this delay is due to a role at NPCs or within the GATOR2 complex, I designed a strategy to specifically impair the interaction between Seh1 and Nup85 (∆N-Nup85), its direct partner within the Y-complex. In the resulting ∆N-Nup85 mutants, Seh1 is no longer detectable at kinetochores and is largely mislocalized from the NPC. In parallel, I constitutively inactivated Mios, another member of the GATOR2 complex. Surprisingly, the resulting ∆N-Nup85 and Mios-/- cells did progress through differentiation and no cell growth delay was observed. Interestingly, we observed an unexpected decrease in NPC density in the Seh1-/- and ∆N-Nup85 mESCs that was in contrast not observed in the Mios-/-cells. This pointed to a function of Seh1 in the context of the Y-complex in the regulation of NPC assembly.We also observed a reduction in nuclear size in the Seh1 mutants that is not shared by the ∆-Nup85mutants but that could be consistent with a role of Seh1 within the GATOR2 complex. My research has expanded our knowledge regarding the different roles of Seh1 and has started to tease apart the relative contributions of this protein in its different subcellular contexts.
Abstract FR:
Les complexes des pores nucléaires (NPCs) sont des larges structures macromoléculaires ancrées dans l'enveloppe nucléaire, et composées d'environ 30 protéines différentes appelées nucléoporines ou Nups. Au-delà de leur rôle critique dans le transport des molécules, les NPCs participent à une grande variété de processus biologiques, tels que la division cellulaire, l'organisation de la chromatine et la régulation de l'expression des gènes. Le principal sous-complexe structural des NPCs est le complexe Y-complexe, qui est composé de 9 nucléoporines distinctes. Le Y-complexe est aussi localisé aux kinétochores pendant la mitose où il régule la congression et la ségrégation des chromosomes. Une nucléoporine de ce complexe, Nup133, a été impliquée dans le développement embryonnaire de la souris. Nup133 n’est pas requise pour la survie des cellules souches embryonnaires murines (mESCs) à l'état pluripotent mais devient essentielle lors de leur différenciation. Le Y-complexe joue donc un rôle majeur dans de multiples processus biologiques mais le rôle spécifique de chacune de ses sous-unités n’a pas été étudié en profondeur. En particulier, une nucléoporine, Seh1, est critique pour la localisation du Y-complexe et de plusieurs régulateurs mitotiques clés, notamment Aurora B aux kinétochores. Dans ce contexte, Seh1 apparaît comme un candidat intéressant, non seulement en raison de son implication en mitose, mais aussi parce qu'elle appartient à un second sous-complexe, nommé GATOR2, qui régule indirectement la voie mTORC1. On ne sait toutefois pas si les fonctions mitotiques de Seh1 reposent sur sa localisation au niveau du pore, des kinétochores ou du complexe GATOR2. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont révélé que les mESCs Seh1-/- sont viables à l'état indifférencié, mais que leur viabilité est gravement compromise lors de la différenciation. Nous avons constaté que l'inactivation de Seh1 est associée à un retard dans la progression mitotique et à un allongement général du cycle cellulaire. Contrairement aux études précédentes, le retard mitotique des mESC Seh1-/- n'est pas lié à une délocalisation du Y-complexe ni de la kinase Aurora B au niveau des kinétochores.Pour comprendre si ce retard est dû à un rôle dans les NPC ou au sein du complexe GATOR2, j'ai ensuite conçu une stratégie visant spécifiquement à altérer l'interaction entre Seh1 et Nup85 (∆N-Nup85), son partenaire direct dans le Y-complexe. Dans les mutants ∆N-Nup85 Seh1 n'est plus détectable au niveau des kinétochores et est largement délocalisé du NPC. Cependant, les mESCs ∆N-Nup85 ne présentent aucun défaut de division cellulaire ni pendant la différenciation. D’autre part, j'ai constitutivement inactivé Mios, un autre membre du complexe GATOR2. Les cellules Mios-/- résultantes survivent pendant la différenciation et aucun retard de croissance cellulaire n'a été observé. En plus des défauts mentionnés précédemment, nous avons observé une diminution inattendue de la densité des NPC dans les cellules Seh1-/- et ∆N-Nup85, qui n'a cependant pas été observée dans le mutant Mios. Ceci indique une fonction de Seh1 dans la régulation de l'assemblage des NPC. Remarquablement, nous avons également observé une réduction de la taille dues noyaux des mutants Seh1 qui n'est pas observée dans les mutants ∆N Nup85, ce qui pourrait refléter un rôle de Seh1 dans le complexe GATOR2. Mes recherches ont élargi nos connaissances sur les différents rôles de Seh1 et ont commencé à aborder la localisation critique de cette protéine.