Adressage d'ARN et manipulation génétique des mitochondries dans les cellules végétales et humaines
Institution:
Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
The understanding of the molecular mechanisms which control the genetic system of mitochondria remains restricted. This is mainly due to the impossibility to manipulate their genome with conventional methods. We are developing an alternate approach based on the physiological mechanism of tRNA import. We use a tRNA mimic as a shuttle to import into mitochondria in plant cells passenger RNAs attached to its 5' end. Following nuclear transformation and transcription in the nucleus, the chimeric RNAs are targeted to mitochondria. So far, we obtained the import of passenger sequences up to 154 nucleotides in size into the mitochondria of transformed plant cells. The process follows the natural specificity of the tRNA import pathway. A trans-cleaving hammerhead ribozyme targeted to the mitochondrial atp9 mRNA was designed and imported into mitochondria as a passenger RNA attached to the tRNA mimic, yielding the first knockdown of a mitochondrial RNA in plant cells. The associated phenotype was a decrease in cell growth rate. The analysis of the level of about twenty mRNAs showed that the atp9 mRNA knockdown led to a 70% decrease of the nuclear-encoded alternative oxidase (aox-1) mRNA, with a strong drop in the amount of the corresponding protein in mitochondria and a decrease in the oxygen consumption. These results highlight the influence of a mitochondrial event on the expression of a nuclear gene, demonstrating the existence of a retrograde regulation. From a gene therapy point of view, we tried to transpose our shuttling system into human cells. All chimeric RNAs used were retained in the intermembrane space of the mitochondria. Thus, other tRNA mimics need to be tested.
Abstract FR:
La connaissance des mécanismes moléculaires qui contrôlent le système génétique des mitochondries reste très parcellaire. Ceci est largement dû à l'incapacité de manipuler leur génome avec les méthodologies conventionnelles. Nous développons une nouvelle approche basée sur l'import naturel des ARNt. Nous utilisons un mime d'ARNt comme navette pour importer dans les mitochondries des cellules végétales des séquences-passagères fixées en 5'. Après transcription dans le noyau, les ARN chimériques sont adressés aux mitochondries. L'import de séquences allant jusqu'à 154 nucléotides a été obtenu. Le processus suit la spécificité de l'import naturel des ARNt. Un trans-ribozyme à tête de marteau ciblé contre l'ARNm mitochondrial atp9 a été élaboré et importé dans les mitochondries grâce à ce système, entraînant ainsi le premier "knockdown" d'un ARN mitochondrial dans des cellules de plante. Le phénotype associé était un retard de croissance. L'analyse de la quantité d'une vingtaine d'ARNm a permis de démontrer une diminution de 70% de l'ARNm nucléaire de l'oxydase alternative 1 (aox-1) suite au knockdown de l'ARNm atp9, avec une forte chute de la protéine correspondante dans les mitochondries et une diminution de la consommation d'oxygène. Ces résultats mettent en évidence l'influence d'un événement mitochondrial sur l'expression d'un gène nucléaire, démontrant ainsi l'existence d'une régulation rétrograde. Dans une optique de thérapie génique, la transposition du système de navette a été tentée dans des cellules humaines. Tous les ARN chimériques élaborés étaient arrêtés dans l'espace intermembranaire des mitochondries. D'autres mimes d'ARNt devront donc être testés.