Dynamique réactionnelle d'inhibiteurs de l'intégrase du VIH-1 : de la solution au milieu cellulaire
Institution:
Paris 11Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Integrase, with reverse transcriptase and protease, is the third viral enzyme that is required for the replicative life cycle of HIV (Human Immunodeficiency Virus). It catalyses the integration of viral DNA into genomic DNA of the host cell. However, no integrase inhibitor is presently employed in therapeutic assays. Nevertheless, the recent progress of structural biology allowed to identify several families of compounds that block the formation of the DNA-integrase complex, among which the 2-styrylquinoline derivatives. This study aims at determining the mechanism of action of these molecules at the molecular level. The first part concerns the study of the photochemical and photophysical properties of the molecules by using steady state and time-resolved absorption and fluorescence spectroscopic methods. The study of the model molecule KHD161 reveals the existence of two types of rotamers, each one exhibiting specific photo-physical properties, and the ability of some molecules to be oxidized by oxygen or photonic activation. The complexation of some active and non active chromophores towards nucleotides, double stranded polynucleotides, and the catalytic core of integrase has allowed to specify the interaction of each molecule with the different biological targets. The results obtained indicate that only the active compounds interact with integrase. In the last part, we compared the data obtained for KHD161 in aqueous medium by fluorescence spectroscopy to those obtained in cellular area, by a fluorescence microscopy system under two photon excitation. The fluorescence intensity and lifetime fluorescence images performed allowed to correlate the dynamic properties of KHD161 with topological information.
Abstract FR:
L'intégras est une enzyme virale essentielle à la réplication du VIH (Virus de l'Immunodéficience Humaine). Elle catalyse l'insertion covalente ou intégration de l'ADN viral dans le génome des cellules infectées. Actuellement, aucun inhibiteur d'intégrase n'est utilisé en clinique. Néanmoins, les progrès récents de la biologie structurale de l'enzyme ont permis de développer de nouveaux inhibiteurs qui bloquent la formation du complexe intégrase-ADN parmi lesquels une famille de composés de type 2-styrylquinoline-catéchol. La première partie de ce travail de thèse porte sur l'étude en solution de la dynamique réactionnelle de ces molécules, au moyen de méthodes de spectroscopie de fluorescence et d'absorption stationnaires et résolues en temps (à partir d'une centaine de femtosecondes). L'étude d'une molécule de référence, KHD161, a permis de révéler l'existence d'un équilibre entre deux formes rotamériques, chacune possédant des propriétés photophysiques spécifiques ainsi qu'une possible oxydation des chromophores aussi bien par l'oxygène que par activation photonique. La complexation d'un ensemble de composés biologiquement actifs et inactifs avec des acides nucléiques isolés, des polynucléotides doubles brins et le coeur catalytique de l'intégrase a permis de préciser la spécificité de reconnaissance et le mode d'interaction de chaque molécule avec les différentes cibles biologiques. Il ressort de cette étude que seuls les composés actifs interagissent avec l'intégrase. Dans la dernière partie de ce travail de thèse, nous avons confronté les données de spectroscopie de fluorescence obtenues avec le composé KHD161 en solution à des mesures directes en milieu cellulaire au moyen d'un système de microscopie de fluorescence par excitation à deux photons. Les images d'intensité et de durées de vie de fluorescence ainsi obtenues ont par ailleurs permis de corréler les propriétés réactionnelles de KHD161 avec des informations topologiques.