Rôle de l'organisation du chromosome III dans la directionalité du mating-type switch chez S. Cerevisiae
Institution:
Toulouse 3Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Epigenetic regulation of gene expression involves chromatin compaction and organization of genomic loci in the nuclear volume. However, little is known about the influence of chromatin structure and dynamics in recombination. Haploid S. Cerevisiae can change mating-type at every cell cycle. During this process, two transcriptionally silent haploid mating-type loci, HMLa and HMRa, located at the opposite ends of chromosome III, are required. Conversion of the mating-type begins with a site-specific cut by the HO endonuclease at the transcribed MAT locus located near the center of the chromosome. The resulting DSB is then repaired by homologous recombination using either HMLa or HMRa as a template. MAT a-cells use HMLa as a template in 85% of the cells whereas a-cells prefer to use HMRa as a template in 90% of the cells. We developed a new fluorescent repressor operator system (FROS) which relies on the transgenic expression of the bacterial λ repressor fused to a fluorescent protein which can bind to its respective λ operator DNA sequence integrated as a short multicopy tandem array in the yeast genome. Combined with the existing FROS based on LacO and TetO it now allows to visualize three specific genomic sites simultaneously. This triple labelling strategy was applied to study the choreography of the three mating-type loci in Saccharomyces cerevisiae. During this study, we uncovered a mating-type specific organization of the chromosome III in S. Cerevisiae. This chromosome organization does not seem to be affected after the abolishment of the chromatin fiber compaction (asf1 mutant) or the silencing ans anchoring of telomeres (sir4 mutant) but is affected following FKH1 deletion. We propose a model in which mating-type specific conformation of chromosome III correlates with the efficiency and the outcome of the gene conversion event between the HM and MAT loci. In fact, the left arm seems to form a loop due to transient interaction of the Recombination Enhancer with centromere proximal sequences. This loop positions the HML region at a strategic region to render it highly recombinogenic. In alpha-cells this specific organization is absent leading to a sequestration of HMLa away from MAT. In addition, we analyzed the behavior of the donor sequences HMLa and HMRa relative to MAT following a DSB at MAT. HMLa seems to sweep away from MAT during the minutes of repair in alpha-cells and come back to its original position following the repair. HMRa gets closer to MAT 30min after HO induction. In conclusion, we propose that the nuclear positioning of the HMLa along the cell cycle is non random and thus controlling the mating-type switch. In perspective, the adaptation of a new FROS system and the development of an algorithm able to analyze 3 loci simultaneously present a new tool to study the chromosome organization role in different cellular mechanism in yeast as well as in other models.
Abstract FR:
La recombinaison homologue est un processus essentiel dans l'évolution des espèces, pourtant les mécanismes qui régulent cet événement sont encore mal connus. Une idée émergente est que l'architecture nucléaire et la conformation des chromosomes influents sur la recombinaison en favorisant la rencontre entre séquences homologues. Le changement de type sexuel chez la levure S. Cerevisiae constitue un excellent modèle pour explorer ce mécanisme. En effet, le changement du type sexuel chez la levure est directionnel c'est-à-dire que suite à une induction d'une cassure double brin (DSB) au niveau du locus MAT par l'endonuclease HO, la cellule répare cette cassure par conversion génique en utilisant un des deux loci HMLa ou HMRa qui se retrouve à l'extrémité de chaque bras du chromosome III. Le locus HMLa sert de donneur d'information si la cellule est de type a et le locus HMRa est utilise lorsque la cellule est a. Nous avons étudiés le rôle de l'organisation nucléaire de ces trois loci ainsi que leur dynamique dans le choix du donneur par microscopie à fluorescence sur des cellules vivantes en utilisant les deux systèmes LacO et TetO ainsi qu'un troisième operator le λO que j'ai adapté pour l'usage chez la levure. Nous avons montré que le chromosome III adopte une organisation mating-type dépendante. Cette organisation spécifique se résume à la formation d'une boucle par l'interaction du RE avec la région centromérique. Cette organisation n'implique pas des facteurs de la compaction de la chromatine comme Asf1 ni des facteurs de mise en silence et d'ancrage des télomères comme Sir4 mais implique Fkh1. De plus, nous pensons que cette organisation est responsable à la relocalisation de HML dans les cellules a dans un endroit qui rend cette séquence recombinogène. En perspectives, la disponibilité de trois FROS ainsi qu'un programme capable d'analyser la position en 3D de trois loci de différentes couleurs, va permettre leur application dans l'étude de l'organisation nucléaire dans d'autres mécanismes cellulaires.