Identification de la signature moléculaire de C/EBPβ dans la cellule d'hépatome humain Hep3B
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Abstract EN:
The liver plays an essential part in complex metabolic regulations which widely contribute to the body homeostasis. Moreover, this organ conducts the qualitative and quantitative changes in the production of specific proteins immediately induced during the acute phase response and allowing a progressive come back to homeostasis. The liver-enriched transcription factor CCAAT enhancer-binding protein beta (C/EBPβ) is widely involved in these processes, but its precise the role isnot still defined. Conflicting studies have described contradictory functions for this transcription factor which could be explained by the complex mechanisms regulating the C/EBPβ activity. Indeed, C/EBPβ encodes an intronless gene that generates a single mRNA that is alternatively translated into two major isoforms : an active LAP (liver-enriched activator protein) and a dominant negative LIP (liver-enriched inhibitory protein). Today, few studies have really taken into account the present isoform. In order to better understand the precise role of each isoform, we first engineered the Hep3B human hepatoma cell line with a Tet-off inducible LAP or LIP isoform. The antagonistic role of the both isoforms in C/EBPβ target-genes transcription has been used as a strategy to better define the C/EBPβ-regulated genes. Then, the identity and the transcription (direct or indirect) of all these target-genes were determined by two functional genomic approaches : the transcriptome analysis by cDNA arrays and the chromatine immunoprecipitation on chip (ChIP on chip). Using a cDNA microarray which provides a complete coverage of the liver transcriptome, we identified 676 genes inversely regulated by LAP and LIP in the Hep3B hepatoma line. The analysis of the biological functions regulated by these genes brought into the flore an induction by LAP and a repression by LIP of several pathways including hepatic metabolism (fat, detoxification), transcription, translation, apoptosis and regulation of the cell proliferation. Moreover, the ChIP on chip study allowed the identification of 38 C/EBPβ new direct targets. According to the data resulting from the transcriptome analysis, several functional studies have been carried out. They allowed us to prove, for the first time, that LAP was, not only able to suppress the cell proliferation in the absence of RB and P53, but that this isoform also increased the staurosporine-induced apoptosis in Hep3B cells while LIP had a protector effect. Furthermore, the Hep3B cells expressing LAP or LIP have been stimulated by a conditioned medium rich in proinflammatory cytokines in order to mimic the hepatic response to the acute phrase of inflammation. In this experimental context, and still by transcriptome analysis, we brought into the fore a group of 77 genes regulated by LAP and LIP which interestingly seem to be involved during the acute phrase response. To conclude, our original approach characterized by the identification of genes inversely regulated by LAP and LIP allowed us to better understand how these two isoforms of C/EBPβ manage several physiological and pathological liver processes.
Abstract FR:
Le foie joue un rôle essentiel dans les régulations métaboliques complexes qui participent largement à l'homéostasie de l'organisme. De plus, cet organe orchestre les changements qualitatifs et quantitatifs intervenant dans la production de protéines de défense immédiatement nécessaires à la réponse à un syndrome inflammatoire aigü systémique et au retour progressif à l'homéostasie qui s'ensuit. Le facteur de transcription CCAAT enhancer-binding protein beta (C/EBPβ) enrichi dans le foie est très impliqué dans tous ces processus. Toutefois, il existe de nombreuses incohérences quant au rôle précisément joué par ce facteur de transcription. En effet, la traduction de son ARNm conduit à la formation de plusieurs isoformes de la protéine qui peuvent être activatrices (LAP) ou inhibitrices (LIP) et peu d'études, à notre connaissance, ont tenu véritablement compte de l'isoforme présente. Pour mieux comprendre le rôle de chacune de ces isoformes, nous avons mis en place, dans la lignée d'hépatome humain Hep3B, un modèle d'expression inductible de la forme activatrice (LAP) ou dominante-négative (LIP) de C/EBPβ. Le rôle antagoniste de ces 2 isoformes dans la transcription des gènes cibles de C/EBPβ a été utilisé comme stratégie pour mieux cerner les gènes régulés par ce facteur de transcription. L'identité et la transcription (directe ou indirecte) de ces ensembles de gènes-cibles de C/EBPβ ont ensuite été mises en évidence grâce à l'utilisation de deux méthodologies à grande échelle : l'analyse du transcriptome par puce à ADN et l'immunoprécipitation de chromatine sur puce (ChIP on chip). L'analyse du transcriptome nous a permis d'identifier 676 gènes inversement régulés par LAP et LIP dans la lignée d'hépatome Hep3B. L'analyse des fonctions biologiques régulées par ces gènes a mis en évidence une induction par la forme activatrice et une répression par la forme dominante-négative de C/EBPβ des voies du métabolisme hépatique (lipides, détoxication), de la transcription, de la traduction, de l'apoptose et des voies impliquées dans la régulation du processus de prolifération cellulaire. De plus, l'étude par ChIP on chip nous a permis d'identifier 38 nouvelles cibles directes de C/EBPβ. Compte tenu des résultats issus de l'analyse du transcriptome, plusieurs études fonctionnelles ont été réalisées. Ces études nous ont permis de démontrer pour la première fois que, non seulement LAP était capable de réprimer la prolifération en l'absence de RB et P53 mais que cette isoforme favorisait également l'apoptose des cellules induite par la staurosporine alors que LIP, à l'inverse, avait un effet protecteur. Par ailleurs, les cellules Hep3B permettant la surexpression contrôlée de LAP ou LIP ont été stimulées par du milieu conditionné riche en cytokines proinflammatoires afin de mimer la réponse hépatique à l'inflammation aigüe systémique. Dans ce contexte expérimental, et, toujours par analyse du transcriptome, nous avons mis en évidence un ensemble de 77 gènes régulés par LAP et LIP. Ces gènes semblent donc être de bons candidats susceptibles de participer activement à la réponse de l'organisme lors d'une inflammation aiguë. En conclusion, notre approche tout à fait originale, caractérisée par l'identification des gènes inversement régulés par les isoformes LAP et LIP de C/EBPβ, a permis de mieux comprendre comment ces deux isoformes régulent plusieurs processus physiologiques et pathologiques du foie.